酸奶中乳酸菌的分離檢測及純化

1、酸奶中乳酸菌的分離檢測及純化,組員：王應(yīng)龍 王英剛 王志軍 吳曉慶 武正芳 2012年11月,【實驗?zāi)康摹?1、了解和掌握乳酸菌菌的菌種特性 2、掌握乳酸菌的分離檢測及純化方法,【實驗原理】,乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。大多數(shù)不運動，少數(shù)以周毛運動。菌體常排列成鏈。根據(jù)細胞形態(tài)為球狀或桿狀，可分為兩大類，即乳酸鏈球菌族（Streptococceae）和乳酸桿菌（Lactobacilleae）。 在1.6%溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上，乳酸菌菌落大約1-3 mm，圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生CaCO3的溶解

2、圈。乳酸菌革蘭氏染色后呈藍紫色。,【實驗材料、儀器與試劑】,實驗材料：市售乳酸飲料或酸奶。 實驗儀器：保溫箱、高壓蒸汽滅菌鍋、水浴鍋、 培養(yǎng)皿、試管、涂布器、酒精燈等。 實驗試劑：脫脂乳試管、脫脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 瓊脂、無菌水,【實驗步驟】,1、1.6%溴鉀酚紫牛乳培養(yǎng)基的制備 2、脫脂乳試管的制備 3、酸奶中乳酸菌的分離 4、乳酸菌的檢測、純化培養(yǎng),（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基的制備,配料： （A）液：脫脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80滅菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，瓊脂20

3、g ，pH6.8， 121濕熱滅菌20min。 操作： （1）、按照配方正確稱取所需藥品放于燒杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解，用1N NaOH或1N HCl調(diào)pH，加瓊脂溶化，加熱過程要不斷攪拌，可適當補水。瓊脂完全溶解后 倒入250mL的錐形瓶中，貼上標簽，在高壓鍋中滅菌20min。 （2）、滅好菌的A液和B液趁熱充分混合，并在酒精燈的附近趁熱倒平板。,（2）、脫脂乳試管的制備,直接選用脫脂乳液或按脫脂奶粉10g與蔗糖5g，水95g（蔗糖與水的比例在1：10的范圍內(nèi)）的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115滅菌15min。,（3）、乳酸飲料或酸奶中乳酸菌的分離,（1）、酸

4、奶菌懸液的配制 取1個潔凈三角瓶，盛以90ml無菌水；7支試管，各盛9ml的無菌水；加塞包扎于在103kPa 121高壓蒸汽滅菌20Min。 將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品10ml加入盛有90ml無菌水的三角瓶中，振搖均勻，即為10-1的樣品稀釋液。 將7只裝9ml無菌水的無菌試管，依次編號1-7，再用無菌移液管吸10-1的菌懸液1ml放入依次裝有9ml無菌水的試管1-6中，稀釋混勻便得到10-210-7的稀釋液。,酸奶菌懸液的配制,另留一管不稀釋留作對照（CK）,（2）、分離方法,A平板劃線 接種環(huán)挑取10-1菌液，按無菌操作對標有”10-1”的3個平板進 行劃操作；劃線完畢后，蓋

5、上皿蓋，倒置放在40恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48小時。,B平板涂布 用無菌移液管分別吸取10-5、10-6、10-7和無菌生理鹽水的稀釋菌懸液各1ml，對號接種于與之對應(yīng)的無菌溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基平板中；盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于試驗臺上20 min；然后倒置于40恒溫箱中培養(yǎng)48小時。,（4）、乳酸菌的檢測、純化培養(yǎng),(1)、初步檢測 恒溫培養(yǎng)48小時過后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對其菌落形態(tài)進行觀察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生CaCO3的溶解圈，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步

6、定為乳酸菌。,（2）、乳酸菌的分離純化培養(yǎng) 選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中，40培養(yǎng)8-24h若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，顯酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色顯陽性，則可將其連續(xù)傳代3次，最終選擇出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。,【注意事項】,采用溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選乳酸菌時，注意挑取典型特征的黃色菌落，結(jié)合鏡檢觀察，有利高效分離篩選乳酸菌。,【結(jié)果與分析】,1、接種不同濃度菌懸液培養(yǎng)基中乳酸菌落數(shù),2、革蘭氏染色結(jié)果,革蘭氏染色結(jié)果為藍紫色，證乳酸菌為革蘭氏陽性菌,3、脫脂乳試管檢測乳酸桿菌,試管中脫脂牛乳凝固，證為乳酸桿菌,4、初步結(jié)果 通過實驗，我們可以得出如下結(jié)果： 酸奶中乳酸菌稱桿狀或排成鏈狀，