小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

1、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn),In vivo Mouse Bone Marrow Cytogenetics Test Micronuleus Assay,食品毒理學(xué),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握哺乳動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)的原理和方法 了解微核試驗(yàn)的意義及應(yīng)用,二、實(shí)驗(yàn)原理,微核（ micronucleus） 細(xì)胞主核之外，大小為細(xì)胞直徑1/20-1/5 圓形或杏仁形，邊緣光滑整齊 染色與主核一致 一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以存在一個(gè)或多個(gè)微核,二、實(shí)驗(yàn)原理,微核成因 染色體或染色單體的無著絲點(diǎn)斷片 紡錘絲受損而丟失的整個(gè)染色體 細(xì)胞分裂后期遺留在胞質(zhì)中，單獨(dú)形成規(guī)則的次核,植物細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)（蠶豆根尖） 淋巴細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

2、 雙核微核實(shí)驗(yàn) 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn),嗜多染紅細(xì)胞（PCE）,嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞，由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個(gè)階段 特點(diǎn)： 1.無主核、易識(shí)別微核（有核細(xì)胞中微核與正常核葉及核的突起難以鑒別） 2.胞內(nèi)含核糖體，染色后成灰藍(lán)色（區(qū)別于成熟紅細(xì)胞，其無核糖體、染色呈淡橘紅色） 3.骨髓中PCE數(shù)量充足，滿足實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)的要求,三、意義及應(yīng)用,檢測化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)。 檢測能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物（DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑）。 輻射損傷、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。,四、器

3、材及試劑,器材：手術(shù)剪、無齒鑷、小型彎止血鉗、干凈紗布、帶橡皮頭吸管、晾片架、玻璃蠟筆、玻璃染色缸、載玻片及推片、定時(shí)鐘、帶油鏡頭顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)器 試劑：小牛血清、生理鹽水、Giemsa貯備液,五、操作步驟,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及處理,動(dòng)物選擇：大、小鼠，小鼠最常用，18-20g，712周齡， 每組10只，雌雄各半。 劑量選擇：以1/5 LD50為最高劑量組，下設(shè)3-4個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)陽 性和陰性對(duì)照。 染毒途徑：經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道、注射。 染毒次數(shù)：多次染毒法（每天染毒一次，連續(xù)4天，第五天取樣） 兩次染毒法（第一次染毒24h后進(jìn)行第二次染毒，6h取樣）,五、操作步驟,本次實(shí)驗(yàn)染毒處理： 環(huán)磷

4、酰胺 劑量：0.8mg/10g 每次染毒(腹腔注射） 次數(shù)：多次染毒法（4次）-最佳濃度及作用時(shí)間,五、操作步驟,骨髓液制備 涂片 染色 觀察與計(jì)數(shù),五、操作步驟,骨髓液制備及涂片 猝死：頸椎脫臼、麻醉 取組織：胸骨、股骨 獲取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：均勻,五、操作步驟,染色 涂片充分晾干后 染色：1. 平置涂片于染色架上，滴加試劑一5滴， 迅速均勻蓋滿涂片，染色1.5 min 2. 不要丟棄試劑一，直接滴加試劑二10滴，輕輕均勻搖晃涂片使染液均勻覆蓋涂片，染色8 min 3. 水洗涂片30s, 待干后鏡檢,五、操作步驟,觀察 顯微鏡的使用 低倍鏡：細(xì)胞群 高倍鏡：分布均勻、

5、染色良好 油鏡：細(xì)胞形態(tài)、微核,觀察 鏡下有3種細(xì)胞： PCE: 灰藍(lán)色 NCE： 橘黃色 有核細(xì)胞：藍(lán)紫色 微核： 藍(lán)紫色、 圓形、 邊緣規(guī)則,五、操作步驟,五、操作步驟,計(jì)數(shù)及結(jié)果分析 1. 總共200個(gè)細(xì)胞中，計(jì)數(shù)PCE與NCE的比值 正常范圍 0.6-1.2 PCE/NCE評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo) P值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：受試化學(xué)物劑量過大，PCE形成受 到嚴(yán)重抑制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠 2. 微核率：含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，以千分率（）表示 （若一個(gè)PCE中出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上微核，仍按有一個(gè)微核細(xì)胞計(jì)數(shù)）,3.陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的微核發(fā)生率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的不同，應(yīng)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道或研究歷史數(shù)據(jù)相一致。 4.統(tǒng)計(jì)分析（Poinsson分布、二項(xiàng)分布、X2檢驗(yàn)等）試驗(yàn)組微核率與陰性對(duì)照組相比有顯著差異時(shí)，可認(rèn)為受試物為具有遺傳毒性。,骨髓微核觀察的步驟 取胸骨 擦凈血污，剔去肌肉 剪去骨骺端 小牛血清 混勻、推片 晾干 Giemsa應(yīng)用液 反面沖洗、晾干 細(xì)胞計(jì)數(shù),六、注意事項(xiàng),骨髓液制備：迅速。在胎牛血清中迅速制取骨 髓液。 涂片及染色：涂片均勻，防止細(xì)胞重疊 染色層次分明（染液新鮮配制、pH、染色時(shí)間） 鏡下觀察：認(rèn)真識(shí)別PCE和NCE 正確區(qū)分微核和涂片上的雜物 顯