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文檔簡介
1、生物信息學(xué),第五章 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析,蘇州大學(xué) 沈百榮 首都醫(yī)科大學(xué) 李冬果,生物信息學(xué),第一節(jié) 引言 Introduction,基因表達(dá)組學(xué)與基因組學(xué)相比較 表達(dá)組信息是動態(tài)的; 表達(dá)組學(xué)的數(shù)據(jù),更多的是數(shù)值分析; 轉(zhuǎn)錄組學(xué)中除了模式識別外,系統(tǒng)建模也十分重要。,真核生物基因表達(dá)的基本方式,基因表達(dá)調(diào)控示意圖,基因表達(dá)的時空性,基因表達(dá)測定方法RT-qPCR,近20年來三種不同高通量基因表達(dá)測定技術(shù)的應(yīng)用趨勢,高通量基因表達(dá)測定的應(yīng)用實例,1.測定組織特異性基因表達(dá) 2.基因功能分類 3.癌癥的分類和預(yù)測 4.臨床治療效果預(yù)測 5.基因與小分子藥物、疾病之間的關(guān)聯(lián) 6.干細(xì)胞的全能型、自我更
2、新和細(xì)胞命運(yùn)決定研究,7.動植物的發(fā)育研究 8.環(huán)境對細(xì)胞基因表達(dá)的作用 9.環(huán)境監(jiān)測 10.物種的繁育,第二節(jié) 基因表達(dá)測定平臺與數(shù)據(jù)庫,Microarray Platform and Databases,1.cDNA 芯片 2.Affymetrix芯片 3.下一代測序技術(shù)技術(shù)如:Roche-454, Illumina MiSeq,Ion Torrent PGM,一、基因表達(dá)測定平臺介紹,二、Microarray技術(shù)與RNA-Seq技術(shù)的比較,1.RNA-Seq技術(shù)對沒有已知參考基因組信息的非模式生物,也可測定轉(zhuǎn)錄信息; 2.RNA-Seq技術(shù)可以測定轉(zhuǎn)錄邊界的精度達(dá)到一個堿基,RNA-Se
3、q可以用來研究復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄關(guān)系; 3.RNA-Seq可以同時測定序列的變異; 4.RNA-Seq背景信號很小,測定的動態(tài)范圍很大。,RNA-Seq在基因表達(dá)的定量上準(zhǔn)確性很高; RNA-Seq在測定技術(shù)上和生物上重復(fù)性很高; RNA-Seq的測定需要很少的RNA樣本。 在應(yīng)用上RNA-Seq技術(shù)對ISOFORM的測定和等位基因的區(qū)分比芯片技術(shù)有很好的優(yōu)勢。,三、基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,疾病相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,第三節(jié)數(shù)據(jù)預(yù)處理與差異表達(dá)分析,Preprocessing of Microarray Data and Analysis of Differentially Expression Gene,一、基
4、因芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理,(一)基因芯片數(shù)據(jù)的提取,cDNA微陣列芯片熒光信號,定性信息提取:P/A/M(Present/Absent/Marginal) 定量信息提?。夯谔结樇瘏R總后的基因水平的熒光信號強(qiáng)度值,原位合成芯片,(二)數(shù)據(jù)對數(shù)化轉(zhuǎn)換,對芯片數(shù)據(jù)做對數(shù)化轉(zhuǎn)換后,數(shù)據(jù)可近似正態(tài)分布,(三)數(shù)據(jù)過濾,數(shù)據(jù)過濾的目的是去除表達(dá)水平是負(fù)值或很小的數(shù)據(jù)或者明顯的噪聲數(shù)據(jù)。 過閃耀現(xiàn)象 物理因素導(dǎo)致的信號污染 雜交效能低 點樣問題 其他,(四)補(bǔ)缺失值,1.數(shù)據(jù)缺失類型 非隨機(jī)缺失 基因表達(dá)豐度過高或過低。 隨機(jī)缺失 與基因表達(dá)豐度無關(guān),數(shù)據(jù)補(bǔ)缺主要針對隨機(jī)缺失情況。,高表達(dá)基因的數(shù)據(jù)缺失,2.數(shù)據(jù)
5、補(bǔ)缺方法,(1)簡單補(bǔ)缺法,missing values = 0 expression missing values = 1 expression (arbitrary signal) missing values = row (gene)average missing values = column (array)average,(2)k近鄰法,選擇與具有缺失值基因的k個鄰居基因 用鄰居基因的加權(quán)平均估計缺失值 參數(shù) 鄰居個數(shù) 距離函數(shù),(3)回歸法,(五)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,1.為什么要進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化:存在不同來源的系統(tǒng)誤差 染料物理特性差異(熱光敏感性,半衰期等) 染料的結(jié)合效率 點樣針差異 數(shù)
6、據(jù)收集過程中的掃描設(shè)施 不同芯片間的差異 實驗條件差異,2.運(yùn)用哪些基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理 芯片上大部分基因(假設(shè)芯片上大部分基因在不同條件下表達(dá)量相同) 不同條件間穩(wěn)定表達(dá)的基因(如持家基因) 控制序列(spiked control) 在不同條件下表達(dá)水平相同的合成DNA序列或外源的DNA序列。,3. cDNA芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理,(1)片內(nèi)標(biāo)化(within-slide normalization)方法 全局標(biāo)化、熒光強(qiáng)度依賴的標(biāo)準(zhǔn)化、點樣針組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化。,假設(shè): R=k*G 方法: c=log2k:中值或均值,全局標(biāo)化(global normalization),熒光強(qiáng)度依賴的標(biāo)化(intens
7、ity dependent normalization),為什么 方法: scatter-plot smoother lowess擬合 c(A)為M 對A 的擬合函數(shù) 標(biāo)化后的數(shù)據(jù),點樣針依賴的標(biāo)化(within-print-tip- group normalization),為什么 一張芯片的不同區(qū)域運(yùn)用不同的點樣針點樣,從而引入點樣針帶來的系統(tǒng)誤差。 method,(2)染色互換實驗(dye-swap experiment)的標(biāo)化 實驗組 對照組 芯片1 cy5(R) cy3(G) 芯片2 cy3(G) cy5(R) 前提假設(shè):cc 方法:,線性標(biāo)化法(linear scaling met
8、hods) 與芯片內(nèi)標(biāo)化的尺度調(diào)整(scale adjustment)方法類似。 非線性標(biāo)化法(non-linear methods) 分位數(shù)標(biāo)化法(quantile normalization) 兩張芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)的分位數(shù)標(biāo)化至相同,即分布于對角線上。,(3)片間標(biāo)化(multiple-slide normalization),4. 芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,對每個探針對計算R R = (PM MM )/ (PM + MM ) 比較R與定義的閾值Tau(小的正值,默認(rèn)值為0.015 ) 單側(cè)的Wilcoxons Signed Rank test產(chǎn)生p值,根據(jù)p值定義定量信號值 Present call
9、 Marginal call Absent call,(1) 提取定性信號,分析步驟 獲取探針?biāo)綌?shù)據(jù)背景值效正標(biāo)準(zhǔn)化處理探針特異背景值效正探針集信號的匯總,(2)提取定量信號,1,分析方法,2,3,4,5,6,M = log2R - log2G A = (log2R + log2G)/2,7,8,9,前面提及的標(biāo)準(zhǔn)化方法僅效正了數(shù)據(jù)分布的中心,在不同的柵格間log-Ratios 的方差也不同。,二、差異表達(dá)分析基本原理與方法,(一)倍數(shù)法,實驗條件下的表達(dá)值,對照條件下的表達(dá)值,通常以2倍差異為閾值,判斷基因是否差異表達(dá),(二)t 檢驗法,運(yùn)用t 檢驗法可以判斷基因在兩不同條件下的表達(dá)差異是
10、否具有顯著性,(三)方差分析,兩種或多種條件間下基因表達(dá)量的比較,用方差分析。它將基因在樣本之間的總變異分解為組間變異和組內(nèi)變異兩部分。通過方差分析的假設(shè)檢驗判斷組間變異是否存在,如果存在則表明基因在不同條件下的表達(dá)有差異。,(四)SAM 法(significance analysis of microarrays),1. 多重假設(shè)檢驗問題 型錯誤(假陽性) 在假設(shè)檢驗作推斷結(jié)論時,拒絕了實際上正確的檢驗假設(shè),即將無差異表達(dá)的基因判斷為差異表達(dá)。 型錯誤(假陰性) 不拒絕實際上不正確的,即將有差異表達(dá)的基因判斷為無差異表達(dá)。,在進(jìn)行差異基因挑選時,整個差異基因篩選過程需要做成千上萬次假設(shè)檢驗,
11、導(dǎo)致假陽性率的累積增大。對于這種多重假設(shè)檢驗帶來的放大的假陽性率,需要進(jìn)行糾正。常用的糾正策略有Bonferroni效正,控制FDR(false discovery rate)值等。,2. 分析步驟 計算統(tǒng)計量 擾動實驗條件,計算擾動后的基因表達(dá)的相對差異統(tǒng)計量 計算擾動后的平均相對差異統(tǒng)計量,確定差異表達(dá)基因閾值 以最小的正值和最大的負(fù)值作為統(tǒng)計閾 值,運(yùn)用該閾值,統(tǒng)計在值中超 過該閾值的假陽性基因個數(shù),估計假陽性發(fā)現(xiàn)率FDR值。 調(diào)整FDR值的大小得到差異表達(dá)基因。,(五)信息熵,運(yùn)用信息熵進(jìn)行差異基因挑選時,不需要用到樣本的類別信息,所以運(yùn)用信息熵找到的差異基因是指在所有條件下表達(dá)波動比
12、較大的基因。,三、差異表達(dá)分析應(yīng)用,以一套阿爾海茨默病相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(GSE5281)為例,詳細(xì)介紹如何利用BRB-ArrayTools軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理,并對處理過的標(biāo)準(zhǔn)化的基因芯片數(shù)據(jù)利用SAM軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析的過程。,GSE5281數(shù)據(jù)是利用Affymetrix公司的寡核苷酸芯片HG-U133 Plus 2.0 Array檢測阿爾海茨默病病人和正常老年人大腦中六個不同區(qū)域的基因表達(dá)情況,本例僅選擇其中一個區(qū)域內(nèi)側(cè)顳回(middle temporal gyrus,MTG)的數(shù)據(jù)進(jìn)行說明 。,第一步:導(dǎo)入芯片數(shù)據(jù),使用“import data”下的“General Format I
13、mporter”導(dǎo)入基因芯片數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)間用Tab鍵分隔(或使用Excell文件),也可使用“Data Import Wizard”進(jìn)行導(dǎo)入 。,導(dǎo)入芯片數(shù)據(jù),第二步:選擇文件類型,每張芯片用單獨的文件存儲,多個文件保存在一個文件夾 “Array are saved in separate files stored in one folder” 若多張芯片數(shù)據(jù)組織成一個矩陣形式,存儲在一個文件中 “Array are saved in horizontally aligned file”,選擇記憶芯片數(shù)據(jù)文件類型,第三步:選擇芯片數(shù)據(jù)文件所存儲的路徑,注意路徑中不能包含中文,第四步:選擇基因芯片
14、平臺,第五步:選擇文件格式,第六步:數(shù)據(jù)的過濾和標(biāo)準(zhǔn)化,第七步:基因注釋,由于基因芯片檢測的是探針的表達(dá)情況,而探針和基因之間往往不是一一對應(yīng),所以,在數(shù)據(jù)導(dǎo)入后軟件會詢問是否需要進(jìn)行基因注釋,及是否需要將探針轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的基因名(gene symbol)或Entrez ID,第八步:運(yùn)行SAM,FDR=0.01, delta=0.68,選出2209個在阿爾海茨默病病人和正常人腦組織中表達(dá)發(fā)生顯著性改變的基因。,SAM的參數(shù)設(shè)定,第九步:SAM Plot,SAM Plot,第四節(jié) 聚類分析與分類分析,Clustering Analysis and Classification,一、聚類目的,基于
15、物體的相似性將物體分成不同的組,二、基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的聚類,對基因進(jìn)行聚類 識別功能相關(guān)的基因 識別基因共表達(dá)模式 對樣本進(jìn)行聚類 質(zhì)量控制 檢查樣本是否按已知類別分組 發(fā)現(xiàn)亞型,樣本,基因,三、距離(相似性)尺度函數(shù),幾何距離 線性相關(guān)系數(shù) 非線性相關(guān)系數(shù) 互信息,四、聚類算法,層次聚類算法將研究對象按照它們的相似性關(guān)系用樹形圖進(jìn)行呈現(xiàn),進(jìn)行層次聚類時不需要預(yù)先設(shè)定類別個數(shù),樹狀的聚類結(jié)構(gòu)可以展示嵌套式的類別關(guān)系。,(一)層次聚類,在對含非單獨對象的類進(jìn)行合并或分裂時,常用的類間度量方法。,類間相似性度量方法,2000年Alizadeh等運(yùn)用基因芯片數(shù)據(jù),基于層次聚類算法證實了DLBCL腫瘤病
16、人在mRNA層面確實存在兩種亞型,(二)k 均值聚類,基本思想,(三)自組織映射聚類,基本思想 在不斷的學(xué)習(xí)過程中,輸出層的神經(jīng)元根據(jù)輸入樣本的特點進(jìn)行權(quán)重調(diào)整,最后拓樸結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。,(四)雙向聚類,雙向聚類就是識別基因表達(dá)譜矩陣中同質(zhì)的子矩陣,運(yùn)用特定的基因子類識別樣本子類。,雙向聚類識別同質(zhì)的子結(jié)構(gòu),五、分類分析,(一)線性判別分類器,(二)k 近鄰分類法,(三)PAM方法 (prediction analysis for microarray),基本思想 每類樣本的質(zhì)心向所有樣本的質(zhì)心進(jìn)行收縮,即收縮每個基因的類均值,收縮的數(shù)量由值決定。當(dāng)收縮過程發(fā)生時,某些基因在不同類中將會有相同
17、的類均值,這些基因就不具有類間的區(qū)別效能。,基因1,基因2,分析步驟,計算統(tǒng)計量 對公式經(jīng)過變換得到,收縮各類的均值,判斷新樣本類別,(四)決策樹,基本思想 決策樹又稱多級分類器,它可以把一個復(fù)雜的多類別分類問題轉(zhuǎn)化為若干個簡單的分類問題來解決。 決策樹的結(jié)構(gòu):一個樹狀的結(jié)構(gòu),內(nèi)部節(jié)點上選用一個屬性進(jìn)行分割,每個分叉都是分割的一個部分,葉子節(jié)點表示一個分布。,決策樹應(yīng)用于腫瘤基因表達(dá)譜的分類分析,分析步驟:提取分類規(guī)則,進(jìn)行分類預(yù)測 在構(gòu)造決策樹的過程中最重要的一點是在每一個分割節(jié)點確定用哪個屬性來分類(或分裂) 這就涉及到關(guān)于使用什么準(zhǔn)則來衡量使用A屬性比使用B屬性更合理,衡量準(zhǔn)則 信息增益
18、information gain 基尼指數(shù)Gini index,決策樹的修剪 消除決策樹的過適應(yīng)問題 消除訓(xùn)練集中的異常和噪聲,(五)分類效能評價,1.構(gòu)建訓(xùn)練集和檢驗集 n倍交叉驗證(n-fold cross validation) Bagging(bootstrap aggregating) 無放回隨機(jī)抽樣 留一法交叉驗證 (leave-one-out cross validation,LOOCV),2.分類效能 靈敏度(sensitivity,recall) 特異性(specificity) 陽性預(yù)測率(positive predictive value,precision) 陰性預(yù)測率(negat
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