第8章-酵母基因工程---基因工程原理與技術---劉志國-課件.ppt

1、第二節(jié) 常見的酵母基因表達系統(tǒng),第八章 酵母基因工程,酵母菌表達載體,酵母基因表達宿主系統(tǒng),第一節(jié) 酵母基因工程表達體系,第四節(jié) 酵母基因工程應用舉例-利用重組酵母生產乙肝疫苗,酵母菌的轉化系統(tǒng),第三節(jié) 影響外源基因表達的因素,酵母菌的分類學特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔子菌綱、半知菌類，共由56個屬和500多個種組成。,酵母菌是比較成熟的真核生物表達系統(tǒng)。,第一節(jié) 酵母基因表達體系 -宿主系統(tǒng),作為宿主細胞的酵母需滿足的基本要求,安全無毒，沒有致病性。 遺傳背景清楚，容易進行遺傳操作。 外源DNA容易導入宿主細胞，轉化效率高。

2、 培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā)酵。 有較強的蛋白質分泌能力。 有類似高等真核生物的蛋白質翻譯后的修飾加工能力。,酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢,全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便,能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中,具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng),大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉,不含有特異性的病毒、不產內毒素，美國FDA認定,為安全的基因工程受體系統(tǒng),酵母菌是最簡單的真核模式生物,常用的酵母宿主菌,目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母菌包括：,釀酒酵母屬 如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,克魯維酵亞母屬 如乳酸克魯維

3、酵母（Kluyveromyces lactis）,畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）,裂殖酵母屬 如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）,解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）,其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，,但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。,假絲酵母屬 產朊假絲酵母 (Candida utilis),酵母菌表達系統(tǒng)的選擇,釀酒酵母的基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉錄活性較高的甘油,醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫,釀酒酵母表達系統(tǒng),酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源

4、蛋白獲得成功表達。,釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得,有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能,大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統(tǒng)來彌補。,乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質粒pKD1已被廣泛用作重組異源,蛋白生產的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也,乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng),能穩(wěn)定遺傳40代以上。,乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu),于釀酒酵母表達系統(tǒng)。,巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生,巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng),長，甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達。,表達系統(tǒng)優(yōu)勢： 生長迅速、強啟動子（

5、乙醇氧化酶基因AOX1） 、可誘導表達,由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體，所以,外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因,20余種具有經濟價值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達。,的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數的多寡。目前已有,多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復制序列,多型漢遜酵母表達系統(tǒng),HARS已被克隆，并用于構建克隆表達載體， HARS質粒,能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上（可連續(xù)整合100多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在內的數種外源蛋白在該,個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構建也是采取整合的策略。,系統(tǒng)中獲得成功表達。,釀酒酵母中的2m環(huán)狀質粒,

6、同源重組,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,環(huán)狀質粒，拷貝數達50至100個。,IRs 反向重復序列，600 bp，重組,FLP 編碼產物驅動IRs的同源重組,REP 編碼產物控制質粒的穩(wěn)定性,STB REP的結合位點,接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及,克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質,粒類似。,第一節(jié) 酵母基因工程表達體系-載體,第一節(jié) 酵母基因工程表達體系-載體,酵母質粒載體既可以在大腸桿菌復制與擴增、又可以在酵母系統(tǒng)中復制與擴增，故此類載體又稱為穿梭載體（shuttle vector）。 酵母菌-大腸桿菌穿梭表達載體是由來自酵母的部分核酸序

7、列和細菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復制的起點序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個部分主要是作為在大腸桿菌宿主時增殖和篩選組分。酵母部分包括酵母轉化子的篩選組分，主要是與宿主互補的營養(yǎng)缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動子和終止子序列。,第一節(jié) 酵母基因工程表達體系 -載體,1酵母載體的基本結構,DNA復制起始區(qū)：2質粒的復制起始區(qū)及酵母基因組的 自主復制序列（autonomously replicating sequence，ARS）,篩選標記：營養(yǎng)缺陷型篩選或者抗

8、性篩選,整合介導區(qū),有絲分裂穩(wěn)定區(qū),表達盒：,啟動子 ，基因（分泌信號序列 ），終止子,2 酵母載體的種類,酵母整合型質粒YIp： 缺乏酵母的復制起始位點，不能在酵母中自主復制，含有酵母的篩選標記ura3基因。具有整合介導區(qū)， 所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定(a)。,酵母克隆表達載體根據其在酵母中復制形式來分類。分為下列五類 ：,酵母載體按照用途不同可分為克隆載體和表達載體兩類,含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質粒的構建,在大腸桿菌質粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構建出來的質粒稱為YIp。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母

9、菌特定的染色體DNA區(qū)域。,酵母附加體質粒YEp：含有釀酒酵母2m質粒DNA復制有關的序列，該載體在酵母細胞中穩(wěn)定，拷貝數可達60-100。轉化效率高（b）。,酵母復制型質粒YRp：含有來源于酵母的DNA復制起始區(qū)(ARS)，能在酵母染色體外自主復制的一種自主復制型載體，雖然其轉化效率高，在宿主的拷貝數可以達上百個（c）。,ARS為酵母菌中的自主復制序列，0.8-1.5kb，,染色體上每30-40 kb就有一個ARS元件。,以ARS為復制子的質粒稱為YRp,上述兩類質粒在釀酒酵母中的拷貝數最高可達200個，,以2m質粒上的復制元件為復制子的質粒稱為YEp,但培養(yǎng)幾代后，質粒的丟失率高達50%-

10、70%，主要是由于 分配不均勻所致。,2 酵母載體的種類,酵母著絲粒質粒YCp：含有酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細胞分裂過程中，在母細胞和子細胞之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(d)。 CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列,將CEN DNA插入含ARS的質粒中，獲得的新載體稱為YCp .YCp質粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數只有1 - 5個。,酵母人工染色體YAC：酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。 YAC具有自主復制序列（ARS）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位點以及可在細

11、菌和酵母菌中選擇的標記基因。 YAC載體在宿主細胞中以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點?？山邮?00-1000kb的外源DNA片段。,主要結構： 兩個可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 酵母菌著絲粒序列 (centromere4,CEN4)； 一個自主復制序列(ARS1)； 兩個來自嗜熱四膜蟲 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重復序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結構； 在兩個末端序列中間，有一段填充序列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在細菌細胞中穩(wěn)定擴增； Ampr抗性及細菌質

12、粒復制原點； 一個EcoR克隆位點，該位點位于酵母菌Sup4 tRNA基因內。,酵母菌的轉化系統(tǒng),酵母菌的轉化方法,用于轉化子篩選的標記基因,酵母菌轉化方法,原生質球法：酶解酵母細胞壁，產生原生質球，原生質體在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允許DNA進入，然后使原生質球再生新的細胞壁。可以實現(xiàn)轉化，轉化子可達原生質體總數的1-2%。,Li+鹽轉化方法 ：釀酒酵母的完整細胞經堿金屬離子（如Li+等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質粒DNA。醋酸鋰對釀酒酵母有效，對畢赤酵母無效，畢赤酵母轉化一般用氯化鋰有效,優(yōu)點：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA（相差80倍）,酵母菌

13、轉化方法,電擊轉化法：原理是通過利用高壓電脈沖作用，造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進入細胞，也有利于外源DNA等大分子進入 優(yōu)點：不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉化率高（達105 / mg DNA）。,PEG轉化法：PEG 1000,酵母細胞轉化特點,單、雙鏈DNA均可轉化，但單鏈的轉化率是雙鏈的10-30倍,單鏈質粒進入細胞后，能轉化為雙鏈并復制（含有復制子）或,同源整合入染色體（不含復制子）,克隆在YIp上的外源基因，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉化子總數的50-80%,用于轉化子篩選的標記基因,營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核

14、苷酸生物合成基因，如：,LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等,但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難,營養(yǎng)缺陷型的互補基因,用于轉化子篩選的標記基因,其編碼產物只要是毒性物質的抗性蛋白,顯性標記基因,aph 氨基糖苷轉移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰轉移酶 抗氯霉素,dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子,suc2 蔗糖轉化酶 耐受高濃度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑,標記基因,編碼產物,遺傳表型,第二節(jié) 常見的酵母基因表達系統(tǒng),一、 釀酒酵母表達系統(tǒng),1，啟動子,組成型表達的啟動子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動子

15、、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH或GAPl）啟動子,可控性啟動子：半乳糖啟動子（GAL）、酸性磷酸酶啟動子（PHO）、乙醇脫氫酶（ADH2）啟動子、Cu2+螯合蛋白啟動子（CUPI）以及交配a型阻遏系統(tǒng)（MATa/a）,酵母菌啟動子的可控性,pho4TS-PHO5啟動子：,釀酒酵母PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開,PHO4基因編碼產物是PHO5啟動子的正調控因子,因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35時關閉,23誘導表達,溫度控制型啟動子,PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產物在35時失活,酵母菌啟動子的可控性,a a 型啟動子,釀酒酵母有a和a兩種

16、單倍體，分別由MATa和MATa兩個等位基因決定。 a1因子決定a細胞特征表達a2因子阻遏a細胞特征表達a1-a2阻遏a細胞特征表達 編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產生a2變體，它能滅活a1，同時阻遏a型,溫度控制型啟動子,a 型啟動子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型啟動子,受體細胞基因組 重組質粒,a 型啟動子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型啟動子,a2,a1,25,35,（）,酵母菌啟動子的可控性,釀酒酵母,超誘導型啟動子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,基因基底水平表達,GAL1,GA

17、L7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖誘導時，GAL4高效表達，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達,GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由GAL1,GAL7和,GAL10,基因編碼,雜合啟動子：將釀酒酵母的乙醇脫氫酶基因（ADH2）所屬啟動子的上游調控區(qū)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）所屬啟動子的下游基本區(qū)重組在一起，構建出ADH2-GADPH型雜合啟動子,釀酒酵母表達載體,目前已建立的釀酒酵母表達載體有（1）酵母附加體質粒(YEp) （見右圖）；（2）酵母復制型質粒(YRp)；（3）酵母著絲粒質粒(YCp) ；（4）酵母整合型質粒 (YIp)；（

18、5）酵母人工染色體(YAC)。前三類統(tǒng)稱為游離自主復制型質粒載體。含有來自酵母基因組的復制起始區(qū)ARS或者酵母天然質粒2m復制起點序列，能夠自主復制，通常為多拷貝數,釀酒酵母宿主,有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達。如pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對外源基因表達產物的降解作用較小。,提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌,能導致釀酒酵母中重組蛋白產量提高或質量改善的突變類型,ssc1 改善重組蛋白分泌 鈣離子依賴型的ATP酶,ssc2 提高重組蛋白表達 轉錄后加工,rgr 1 提高重組蛋白表達 轉錄水平,ose1 提高重組蛋白表達 轉錄水平,ssc11 改善重組蛋白分泌 羧肽酶Y

19、,rho- 提高重組蛋白表達 轉錄水平,突變類型,生物效應,作用位點,釀酒酵母宿主,為了減少目的蛋白的過度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株、天門冬酰胺側鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外側糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，具有重要實用價值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因為它們不能在異源蛋白的天門冬酰胺側鏈上延長甘露多聚糖長鏈。,抑制超糖基化作用的突變宿主菌,能抑制超糖基化的突變類型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天冬酰胺側鏈糖基化缺陷型,och 外側糖鏈添加缺陷型,突變類型,生物效應,

20、許多真核生物的蛋白質在其天冬酰胺側鏈上接有寡糖基團，,它們常常影響蛋白質的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側糖,鏈兩部分組成。,酵母菌普遍擁有蛋白,質的糖基化系統(tǒng)，但野生,型釀酒酵母對異源蛋白的,糖基化反應很難控制，呈,超糖基化傾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,泛素介導的蛋白質降解作用,蛋白酶體,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因,酵母菌有四個泛素

21、編碼基因：,UBI 1 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數生長期表達 穩(wěn)定期關閉,UBI 2 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數生長期表達 穩(wěn)定期關閉,UBI 3 編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 對數生長期表達 穩(wěn)定期關閉,UBI 4 編碼泛素五聚體 對數生長期關閉 穩(wěn)定期表達,酵母菌有七個泛素連接酶基因：,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,泛素降解途徑衰減的釀酒酵母,釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達，UBI 4-突變株能,UBI 4缺陷型： 外源基因表達理想的

22、受體,正常生長，但細胞內游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，,UBA 1缺陷型：減少蛋白降解,UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導的蛋白降解,Ubc4 - ubc5 雙突變型： 減少蛋白降解,七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效,二、畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng),1. 啟動子,（1） AOX1和AOX2啟動子,（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde 3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）啟動子,（3）甲醛脫氫酶（formaldehyde dehyd

23、rogenase, FLD）啟動子,2 畢赤酵母表達載體類型,胞內表達載體pPICZ A,B,C,分泌型表達載體pPICZa A,B,C,畢赤酵母表達載體上無酵母復制起點，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來說前一種方式更容易發(fā)生 。,3 載體的整合方式,依據具體整合位點及相應產生的轉化子的類型可分為三種情況：,5 AOX1和3 AOX1與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個拷貝的外源基因。這種情況有功能的AOX1基因被替換而丟失后，只能利用弱的AOX2基因啟動合成AOX，就產生

24、His+MutS表型(methanol utilization slow)，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長緩慢。此時，甲醇利用率很低，但它表達外源基因的效率高,染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換，使得一個或多個表達單位插入在his4位點，產生的表型也是His+ Mut+,染色體AOX1區(qū)與載體質粒的AOX1區(qū)發(fā)生單位點互交換，外源基因的表達單位插入在基因區(qū)AOX1基因的上游或下游，這一過程可重復發(fā)生，使得更多拷貝的表達單位插入基因組中。這種情況AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長正常，產生的表型是His+Mut+。,在畢赤酵母中有3種方法可以得到多拷貝表達菌株。 第一種方法直接構

25、建含高拷貝外源基因的表達載體，在體外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達盒。此法的優(yōu)點是一次整合，即可有多個表達盒插入染色體。但體外基因操作較繁瑣。 第二種方法是利用含有kanr基因的載體。細菌來源的卡那霉素抗性基因在酵母中賦予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗性水平大致與載體的拷貝數相關。提高抗生素G418的濃度可以得到含高拷貝表達載體的轉化菌株。 第三種方法是用含有Zeocin抗性標記基因Sh ble的載體來構建多拷貝菌株。來源于細菌的Sh ble在酵母中賦予宿主對抗生素zeocin的抵抗能力，通過提高zeocin濃度可篩選出含高拷貝表達載體的轉化菌株。然而與G418篩選相似，大

26、多數能抵抗高水平 zeocin 的轉化子并不含有多載體拷貝。,4 宿 主,常用的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16， 其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達蛋白可以降低表達產物的降解。這些表達宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生來的。最常用的受體菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一個組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4 的載體而具有 His+表型來篩選轉化子。 根據對甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似，稱為

27、甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；當AOX1被其他基因取代，則需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。當AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為甲醇利用負表型（Mut-），如MC100-3。后兩者胞內表達外源蛋白質有時優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。 此外為增加分泌蛋白質穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4, prb1)。,第三節(jié) 影響外源基因表達的因素,外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度,優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級結構，提高外源基因mRNA的翻譯活性,酵母菌對密碼子的偏愛性,在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質（如甘

28、油醛-3-磷酸脫氫酶,GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%,以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的,一、轉錄水平控制,二、表達載體的拷貝數和穩(wěn)定性,三、其他因素,優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝,避免表達產物在細胞內的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主,第三節(jié) 影響外源基因表達的因素,利用重組酵母生產乙肝疫苗,第四節(jié) 酵母基因工程應用實例,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重,的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其,中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒,還沒有一種有效的治療藥物

29、，因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒,感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產乙型疫苗為其,廣泛應用提供了可靠的保證。,利用重組酵母生產乙肝疫苗,產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母,乙型肝炎病毒的結構與性質,產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母,乙型肝炎病毒的結構與性質,乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈,乙型肝炎病毒的結構,球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要,結構蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化,和非糖基化兩種形式。顆粒內的蛋白包括核心抗原（ HBcAg ）、,此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22,病毒DN

30、A聚合酶、微量病毒蛋白。,nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的,1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽。,乙型肝炎病毒的結構與性質,乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108 aa,55 aa,226 aa,preS1,preS2,S,S 多肽,226 aa,M 多肽,281 aa,L 多肽,399 aa,乙型肝炎病毒的結構與性質,乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的,傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備,乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞膜上提取出來的。這種來源的,疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產業(yè)化。,產乙肝表面

31、抗原的重組釀酒酵母,20世紀80年代開始選擇釀酒酵母表達重組HBsAg，主要工作包括,將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉化子能表達出具有免疫活,性的重組蛋白，它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平,均顆粒直徑為 22 nm，其結構和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中,的病毒顆粒相同。,目前，由釀酒酵母生產的重組HBsAg顆粒的最終產量可達細胞,總蛋白量的1%-2%。,進一步的研究表明，M多肽和L多肽對S型疫苗具有顯著的增效作,用，由三者（或兩者）構成的復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對 S抗,原缺乏響應的人群的免疫反應。,產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母,整合型重組巴斯德畢赤酵母的構建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his+的轉化子,重組分子,轉化his-的受體細胞,染色