RNA-SEQ原理及應(yīng)用.ppt

1、RNA-seq技術(shù)原理和應(yīng)用，報(bào)告人：柳曉東2012.4.16，1，RNA-seq技術(shù)簡介2，RNA-seq技術(shù)原理3，RNA-seq技術(shù)優(yōu)勢4，RNA-seq技術(shù)優(yōu)勢或RNA序列也被稱為轉(zhuǎn)錄組序列，mRNA 一種利用高吞吐量測量序列技術(shù)對小型RNA和非編碼RNA (NC RNA )的全部或一部分進(jìn)行序列分析的技術(shù)。 轉(zhuǎn)錄組的意思：轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞球在某種發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非查詢密碼RNA(non-coding RNA，ncRNA )。 轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，對于解讀染色體組功能的原件、闡明細(xì)胞球及組織分子組成是必要的

2、。 關(guān)于ncRNA、ncRNA的一些知識：非查詢密碼RNA(ncRNA )主要具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)波特酒RNA(tRNA )、核糖體RNA(rRNA )、小核RNA(snRNA )、以及非查詢密碼化RNA對基因的表達(dá)的作用，如對染色體結(jié)構(gòu)的影響、rnna 近年來，利用RNA-seq進(jìn)行序列分析的多篇文章中包含了ncRNA的分析，發(fā)現(xiàn)了很多新的ncRNA。 二、RNA-seq技術(shù)原理、RNA-seq實(shí)驗(yàn)程序流程圖，首先得到細(xì)胞球總RNA，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，例如測定mRNA、ncRNA、smallRNA等，對RNA樣本進(jìn)行處理。 處理后的RNA進(jìn)一步碎片化，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，獲取cDNA實(shí)時(shí)拉力賽，

3、將連接器連接到cDNA片段的兩端，最后以下一代高通量測量序列進(jìn)行測序。 所謂高通量測定序列、高通量測定序列技術(shù)(High-throughput sequencing )，能夠一次并行測定數(shù)十萬到數(shù)百萬個(gè)DNA分子的序列，每個(gè)序列測定的讀取長度一般是短的序列高吞吐量測量序列技術(shù)給傳統(tǒng)序列帶來了革命性的變化，同時(shí)對數(shù)十萬到數(shù)百萬的DNA分子進(jìn)行序列測量，因此在某些文獻(xiàn)中被稱為下一代序列技術(shù)(next generation sequencing )， 高吞吐量測量序列使云同步能夠?qū)δ硞€(gè)轉(zhuǎn)錄組和染色體組進(jìn)行細(xì)致的整體分析，對三種高吞吐量測量序列進(jìn)行了概述： 2005年以來，新一代的測序儀標(biāo)記了Roch

4、e公司的454項(xiàng)技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)此后，Helicos Biosciences公司又發(fā)布了單分子序列測定(SMS )技術(shù)。 3種高通量測量序列技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，高通量測量序列中重要名詞的解釋，1，定序深度：定序所得總堿數(shù)與待測染色體組大小之比。 設(shè)一個(gè)基因組大小為7M，測序總堿基數(shù)為70M，測序深度為10。 2 .展望：通過序列確定得到的序列占染色體組整體的比例。 由于存在染色體組中的高GC含量、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，序列確定的最終史迪奇組裝序列往往不能復(fù)蓋所有區(qū)域，這些個(gè)區(qū)域稱為Gap。 兩者的關(guān)系：序列深度和染色體組的展望度之間存在正相關(guān)關(guān)系

5、，序列錯(cuò)誤率和假陽性結(jié)果隨著序列深度的提高而降低。 如果序列決定深度在1015X以上，就能保證控制基因組的展望度和序列決定錯(cuò)誤率。3、rpkm (readsperkilobasepermillionreads )是每百萬個(gè)讀段中從某個(gè)基因開始每千個(gè)堿基長度的讀段數(shù)。 其公式為：total exon reads指被某基因映射的reads數(shù)，mapped reads指從map到所有基因的總reads數(shù)。 RPKM不僅規(guī)范了測序深度，而且規(guī)范了基因長度，因此不同長度的基因在不同測序深度得到的基因表達(dá)水平估計(jì)值具有可比性，是目前最常用的基因表達(dá)估計(jì)方法。三、RNA-seq技術(shù)的優(yōu)越性在于，相對于傳統(tǒng)的

6、sanger測序方法，RNA-seq具有以下優(yōu)勢： 1、數(shù)字化信號：直接測量各傳輸手抄本片段序列、一元酸極限分辨率精度，并且是傳統(tǒng)微陣列單孢雜交的熒光模擬2 .靈敏度高：稀有的轉(zhuǎn)發(fā)手抄本，可檢測出細(xì)胞球中的至少幾個(gè)拷貝。 3 .任意種類的全染色體組分析：由于不需要設(shè)定和修正特異的探針，所以不需要知道種類的基因信息，可以對任何種類進(jìn)行直接轉(zhuǎn)印組分析。 能夠在云同步中檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄手抄本，正確識別可變剪切位點(diǎn)和cSNP、UTR區(qū)域。SAGE、序列分析、基因表達(dá)系列分析MPSS、massivelyparallelsignaturesequencing、大規(guī)模殘奧信號序列分析、4、rna-

7、。 1、轉(zhuǎn)錄手抄本結(jié)構(gòu)的研究利用單鹽化學(xué)基極限分辨率的RNA-Seq技術(shù)，可以使基因注釋多方面的內(nèi)容極為豐富，包括5/3邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。 RNA-Seq也可以對可變拼接進(jìn)行定量研究。 2 .遺傳手抄本變異研究在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、查詢密碼序列多態(tài)性的研究等，RNA-seq也有很大的潛力。 3、非查詢密碼領(lǐng)域功能研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要方面之一是ncRNA的發(fā)現(xiàn)與分析。 ncRNA根據(jù)其功能分為留守ncRNA和調(diào)節(jié)ncRNA。 前者通常表達(dá)穩(wěn)定，對細(xì)胞球存活發(fā)揮重要的一系列功能，主要包括轉(zhuǎn)移RNA(tRNA )、核糖體RNA(rRNA )、小核RNA(

8、snRNA )及小核RNA(snoRNA )等。 后者主要包括以長鏈ncRNA(lncRNA )和microRNA為代表的小ncRNA(small ncRNA )，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多方面調(diào)控基因表達(dá)。 4、基因表達(dá)水平的研究與以往的芯片技術(shù)相比，RNA-Seq技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地確定細(xì)胞球中RNA的表達(dá)水平。 原則上，RNA-Seq決定了細(xì)胞球群中每一分子的絕對數(shù)量，可以直接比較實(shí)驗(yàn)間的結(jié)果。 RNA-Seq的一個(gè)特別強(qiáng)大的好處是，可以捕獲不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)移組的動(dòng)態(tài)變化，而無需復(fù)雜地標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)定徑套。 5、低豐度新轉(zhuǎn)手抄本的確定可以利用轉(zhuǎn)位子標(biāo)簽和芯片技術(shù)獲得新的轉(zhuǎn)手抄本，但是工作量太大，結(jié)果不確定。 RNA-Seq不被本底噪聲問題所困擾，結(jié)果的精準(zhǔn)性高，因此被用于發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)發(fā)手抄本。 近年來，釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、擬南芥、水稻、小鼠、人白念珠菌轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果均顯示大量新的轉(zhuǎn)錄區(qū)，其中多數(shù)轉(zhuǎn)錄水平低于已知的cDNA基因。 RNA-seq序列數(shù)據(jù)的分析、五、RNA-seq的發(fā)展前景、RNA-seq相對于傳統(tǒng)序列方法