單分子測序PacBio技術(shù)和應(yīng)用解決方案

1、單分子測序PacBio技術(shù)和應(yīng)用解決方案 一、 技術(shù)原理 SMRT：single molecular real time Sequencing PacBio RS，RS表示Real time Sequencing 關(guān)鍵之一：DNA聚合酶 基本原理：DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標記4種堿基，經(jīng)過Watson配對后不同的堿基加入，會發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。和其他基本測序技術(shù)一樣，在反應(yīng)管中進行的是大規(guī)模平行的多分子反應(yīng)，怎樣在其中進行單分子反應(yīng)檢測？周圍有大量的熒光標記的游離堿基，怎樣將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區(qū)別出來？ 通過一個物理現(xiàn)象解釋：ZMW（z

2、ero-mode waveguides，零模波導(dǎo)孔）。例如微波爐壁上可看到有很多密集的小孔。小孔直徑有考究，如果直徑大于微波波長，能量就會穿透面板泄露。如果孔徑小于波長，能量不會輻射外部，起保護作用。 在一個反應(yīng)管（SMRTCell：單分子實時反應(yīng)孔）中有許多這樣的圓形納米小孔，即ZMW（零模波導(dǎo)孔），外徑100多納米，比檢測激光波長小（數(shù)百納米），激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個小范圍（體積20X 10-21L）里，正好足夠覆蓋需要檢測的部分，使得信號僅來自這個小反應(yīng)區(qū)域，孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中，將背景降到最低。 單個ZMW底部固定有一個結(jié)合了模板

3、DNA的聚合酶，當(dāng)加入測序反應(yīng)試劑后，每個堿基配對合成后會發(fā)出相應(yīng)的光并被檢測。一個SMRTCell中有15萬個ZMW，每個孔中有一個單分子DNA鏈在高速合成，如眾星閃爍。原始檢測數(shù)據(jù)的結(jié)果，每合成一個堿基即顯示為一個脈沖峰，每分鐘100個堿基的速度，配上高分辨率的光學(xué)檢測系統(tǒng)，就能實時檢進行檢測。 關(guān)鍵點之二：熒光標記位點。這是影響測序長度的非常關(guān)鍵的因素。二代測序都標記在5端甲基上，在合成過程中，熒光標記物保留在DNA鏈上，隨DNA鏈的延伸會產(chǎn)生三維空間阻力導(dǎo)致DNA鏈延長到一定程度后會出現(xiàn)錯讀。這是NGS的測序讀長僅能達到100多bp到200bp的一個原因。 PacBio平臺的堿基熒光標

4、記在3端磷酸鍵。在DNA合成過程中正確的堿基進入時，在3端磷酸鍵的標記是會隨磷酸鍵斷裂自動被打斷，標記物被棄去，亦即合成的DNA鏈不帶熒光標記，和天然的DNA鏈合成產(chǎn)物一致，可以達到很長的讀長。關(guān)鍵點之三：時空段概念 合成過程中，每次進入一個堿基，原始數(shù)據(jù)會實時地產(chǎn)生一個脈沖峰，每兩個相鄰的脈沖峰之間有一定的距離，也就是有一個時間段的概念。距離與模板上堿基是否存在修飾有關(guān)，如果有堿基修飾，就像開車經(jīng)過路障時，通過速度會減慢，導(dǎo)致兩個相鄰峰之間距離加大。根據(jù)這個距離的變化，可以判斷模板相應(yīng)位點是否出現(xiàn)堿基修飾，并且結(jié)果是實時的。甲基化就是一種主要的堿基修飾，PacBio技術(shù)不僅可以提供序列信息，

5、還可提供實時信息了解模板修飾的情況，用于甲基化等堿基修飾研究。 二、 測序流程和策略 配件：SMRT cell chip（小拇指指甲蓋大小）。一條strip可以放8個SMRT cell，儀器一次可運行2條strip，共16個SMRT cell 文庫構(gòu)建試劑盒，測序試劑盒 流程和策略 1. 文庫制備 材料：全基因組DNA，或者cDNA，或者目標擴增產(chǎn)物 片段化：全基因組太大需要片段化，因為測序讀長很長，可以做很大的片段文庫（3-10kb） 連接：先把片段粘末端變成平端，兩端分別連接環(huán)狀單鏈：單鏈兩端分別與雙鏈正負鏈連接上，得到一個類似啞鈴（“套馬環(huán)”）的結(jié)構(gòu)，稱為SMRT Bell。連接半小時內(nèi)

6、完成。（問題：片段化用什么方法？兩端的環(huán)狀單鏈是同一序列嗎？如何確定單鏈方向？如果兩端一樣，如何分辨正負鏈？如何排除其他連接產(chǎn)物？連接效率有多高？如何純化去掉酶？） 關(guān)于以上文庫制備問題跟NGS類似，比如用片段化儀進行片段化，加接頭等等。通過優(yōu)化的實驗protocol進行各步驟的優(yōu)化。 如此，文庫制備完成，簡單快速。無需擴增。沒有擴增偏向性，高或低GC含量區(qū)域覆蓋均勻，尤其不會湮沒稀有突變。 2 引物退火 + 聚合酶結(jié)合 當(dāng)引物與模板的單鏈環(huán)部位退火后，這個雙鏈部位就可以結(jié)合到已固定在ZWM底部的聚合酶上（問題：大分子DNA進入小孔的擴散速度？是否會存在有的ZMW沒有模板進入的情況？SMRTC

7、ell中樣本和測序反應(yīng)體系的配置都是在測序儀中程序化自動完成的，簡單快捷，標準化。會，目前的通量基于目前的進入效率，因此這方面還有提高的空間）。 3. 測序策略 萬事俱備，一旦向反應(yīng)中加入正常的離子，DNA聚合反應(yīng)開始了。模板雙鏈打開成環(huán)形，先合成正鏈，單鏈區(qū)，跟著合成負鏈。聚合酶每合成一圈，對于定向目標序列，就相當(dāng)于2x覆蓋度。由于合成產(chǎn)物和天然產(chǎn)物一致，聚合酶可以持續(xù)合成很長很長的產(chǎn)物，亦即循環(huán)合成很多圈（重復(fù)多次），對于定向單分子目標序列來說就可以得到很高的覆蓋度，即獲得很多subread，這就意味著可以對非常低的頻率的片段獲得很高的準確度，這稱為環(huán)形一致序列（circle consen

8、sus）模式，該模式適用于稀有突變及需要高精確度的測序。這也是單分子測序能比NGS靈敏度更高地，高準確度地檢測到稀有突變的原理。 除了特有的環(huán)形一致序列（circle consensus）模式外，也可以通過增加同一序列的覆蓋度（在不同ZMW中）獲取高的一致性準確度。單分子覆蓋度和獲取序列一致性準確度的關(guān)系 QV 10代表90%準確度，20代表99%準確度，30代表99.9%準確度，40代表99.99%準確度，50代表99.999%準確度。由圖可見，5個單分子疊加可以得到99%準確度，10個單分子疊加可以得到99.9%準確度，15個單分子疊加可以得到99.99%，20個單分子疊加可以得到5個9的

9、準確度。類推。而對于因此可以看出，利用環(huán)形一致序列模式這個策略，對同一單分子就可以得到非常非常高的準確度。 三、 Q&A 1. 關(guān)于準確度差的說法如何解釋？ 回答補充于此：單分子測序1覆蓋度的精確度為87.5，這是由于在測序過程中單個分子信號弱，偶爾會出現(xiàn)信號難于分辨的情況。出錯幾率是隨機的，和序列長度、序列組成無關(guān)。要提高準確率，只需要提高循環(huán)次數(shù)，提高單分子覆蓋度即可，15個單分子疊加可以得到99.99的精確度。（問題：是否就是相當(dāng)于200bp長度目標序列，15個循環(huán)？用PCR擴增結(jié)果測序是否能通過提高重復(fù)拷貝數(shù)而提高覆蓋度，從而同時達到長片段和高度精確的目的？是，可以通過提高重復(fù)拷貝數(shù)或

10、對同一單分子環(huán)形測序兩種方式，或二者結(jié)合，達到要求的覆蓋度及準確度。）一代和二代測序的每一個反應(yīng)，本來就是N個分子同時疊加反應(yīng)所得到的平均信號。如果需要很長的讀取，策略是構(gòu)建3 kb-10 kb的文庫，就可以獲得長的讀長，這就是continuous longread模式。這種模式，很長的讀長適合做全基因組序列組裝骨架。讀長分布圖。平均讀長3.1kb，top 5% 讀長大于8kb，最長讀長14.7kb。（問題：按照每分鐘100bp速度，平均30分鐘內(nèi)完成測序，最長需要2個多小時？如何平衡時間？讀最長的酶有何不同？為何能讀這么長？是序列變化，還是構(gòu)象變化，還是固定的問題？目前有標準的protoco

11、l，長片段測序推薦為90min，實時上酶反應(yīng)速度非?？?，100bp，讀長主要跟酶的活性保持有關(guān)，主要受激光對它的損傷的影響，當(dāng)然其它如序列本身，構(gòu)象也會有一定影響。廠家還在不斷優(yōu)化聚合酶的性能，比如給聚合酶加上免受激光影響的保護基團等，進一步地提高讀長，提高測序質(zhì)量和通量）。四、 技術(shù)應(yīng)用 一種新技術(shù)的應(yīng)用，通常倚借其技術(shù)特長的優(yōu)勢。 PacBio單分子測序的技術(shù)特征 超長的讀長de novo測序中完整基因組的組裝； Target測序中多個突變位點的單倍體型檢測，復(fù)雜的多個重復(fù)片段的準確測定，長轉(zhuǎn)錄本及可變剪切體測定等等 超高測序準確度及單分子分辨率特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定

12、動態(tài)信息可獲得甲基化等多種堿基修飾信息 1. 超長的讀長 二代測序的短處在于讀長太短。就像拼圖游戲，越碎的碎片就越難拼接。雖然提供海量的數(shù)據(jù)，但是依然不足以完成全基因組拼接。去年在Nature上發(fā)表的一篇綜述文章指出，二代測序讀長太短是其技術(shù)的內(nèi)有問題（fundamental data properties），數(shù)學(xué)模式所不能解決的。算法已經(jīng)很成熟，算法再好，也不足以解決這個問題。 PacBio的超長讀長，可實現(xiàn)以相對較低的覆蓋度達到很好的序列組裝。有助于產(chǎn)生較少的重疊群，幫助全基因組組裝。還可以獲得復(fù)雜的DNA重組信息，比如由于斷裂造成的融合基因的Breakpoint，cDNA里包含的剪切，內(nèi)

13、外顯子間的關(guān)系，都需要很長的讀長幫助組裝跨越的區(qū)域。 因此，對于全基因組de novo測序來說，更適宜用組合的方法，將第三代和第二代測序方式結(jié)合。冷泉港去年宣布研發(fā)一個軟件，能將PacBio結(jié)果和二代測序結(jié)果結(jié)合。 舉例： 美國能源部對一個微生物進行測序，用二代測序最好的結(jié)果可以組裝得到58個重疊群contig.，而用PacBio可以直接得到一個contig，一步完成全基因組組裝。 轉(zhuǎn)錄本剪切變異體：可檢測出一個基因的13個剪切變異體，原因在于讀長大，跨度大。 美國農(nóng)業(yè)部對羊體內(nèi)微生物進行測序。用二代測序沒能組裝起全基因組，最少也有18個contig。用PacBio，用6K長度21x覆蓋度，可

14、以組裝成單個contig。這說明長序列測序確實可以幫助組裝。另外一個重要問題，GC%對測序覆蓋度的影響：對于二代測序技術(shù)，GC含量高的地方覆蓋度低，即使再提高全基因組覆蓋度，但富含GC的區(qū)域覆蓋度還是難以提高，無法填補。這就造成用二代測序很難完成一些物種的全基因組測序的原因，或者有的全基因組測序結(jié)果存在不少洞的原因。 單分子測序平臺很適合困難基因組的測序，比如GC含量很高，AT含量很高，多堿基串聯(lián)重復(fù)（如CGG重復(fù)），普通測序技術(shù)很難獲得結(jié)果。這個平臺對這類很難測序的區(qū)域都能平穩(wěn)的測序。單分子測序結(jié)果顯示這種技術(shù)覆蓋度不隨GC含量變化而變化，曲線平穩(wěn)。均一的覆蓋度對全基因組測序的完成非常重要。

15、 舉例，全長cDNA測序結(jié)果。5端轉(zhuǎn)錄本開始，4號外顯子，5號外顯子，3UTR，polyA區(qū)。polyA區(qū)域100多個A的測序峰非常清晰。然后到套馬環(huán)區(qū)，然后到PolyT 區(qū)。能測長PolyA對研究RNA的代謝有重要意義，RNA的半衰期和PolyA長度有關(guān)，對其穩(wěn)定性很有意義。 中心粒測序：中心粒的一段序列有很高重復(fù)，用Sanger和二代測序都很難得到結(jié)果，用PacBio能夠完成。 脆性X綜合癥的大量重復(fù)的CGG序列都可以測序。 2. 動態(tài)信息可獲得甲基化等修飾信息的例子 PacBio提供實時的測序，一能提供測序結(jié)果，即堿基的排列組合，二是可以提供基因修飾的信息（PacBio技術(shù)對甲基化的檢測

16、可參考Nature Method發(fā)表的一篇文章）其原理在于，當(dāng)聚合酶合成每一個堿基，都有一個時間段，兩個相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離可以算一個比值，稱為IPD。當(dāng)模板堿基帶有修飾時，聚合酶會慢下來，就像行車過程中遇到路障。兩個相鄰的脈沖峰之間的距離就會延長。當(dāng)看到某個堿基IPD比例明顯大于1時，就可以推斷這個位置有修飾。 德國致命性大腸桿菌爆發(fā)事件 由于食物污染了致命性大腸桿菌而導(dǎo)致數(shù)千人出現(xiàn)了腸出血性急性腹瀉，導(dǎo)致50人死亡。3個研究小組分別對該事件中的爆發(fā)性大腸桿菌進行測序，來分析其基因型。 德國小組采用二代測序，2個樣本，參照序列比對測序，聚類分析結(jié)果得出是EHEC亞型。Pac

17、Bio與哈佛大學(xué)合作，對2711爆發(fā)株進行的de novo測序組裝。證實是EAEC亞型，結(jié)果發(fā)表在同一期的新英格蘭雜志。測序結(jié)果也發(fā)現(xiàn)基因組出現(xiàn)了一個外源嗜菌體帶入的一段基因，上面有志賀毒素基因。 PacBio小組邀請New England Biolabs公司協(xié)助對該大腸桿菌株測序結(jié)果進行甲基化方面的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明該基因組上確實有很多甲基化出現(xiàn)（約45000個）。通過排除法，發(fā)現(xiàn)爆發(fā)株里有CTGCAG motif特有的甲基化，還發(fā)現(xiàn)插入的外源序列中還有一段序列類似甲基化酶，可專門對CTGCAG的序列進行甲基化。對CTGCAG甲基化有關(guān)的基因表達分析，發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的基因包括菌毛，鞭毛體

18、和與細胞注入有關(guān)的基因，這些結(jié)果也許可能解釋為嗜菌體侵染而注入一段外源基因，其中包含一種甲基化酶，導(dǎo)致爆發(fā)株表達改變，提高對宿主吸附性，連同志賀毒素，而導(dǎo)致毒性升高。最后功能學(xué)實驗證明，將該爆發(fā)株注入兔子，同樣出現(xiàn)出血性腹瀉癥狀，而當(dāng)基因敲除這個甲基化酶，再注入兔子，癥狀消失。由此可見，正由于Pacbio的第三代測序系統(tǒng)得到堿基序列信息的同時獲得了堿基修飾的信息，我們可同時對堿基序列和堿基修飾兩方面測序信息進行分析，可以完整解釋爆發(fā)株的強毒性的基因組機制，為表觀遺傳學(xué)及疾病基因組學(xué)開辟了新的研究思路。目前該論文正在接受評議之中。 5hmC的檢測 5hmC非常重要的表觀標記，被譽為第6個堿基。是

19、細胞分化和組織發(fā)育中的重要的標記。在PacBio測序過程中發(fā)現(xiàn)IPD峰值不夠明顯，需要對其進行富集修飾。經(jīng)過富集和修飾的序列測序結(jié)果可以顯著檢測出5hmC，甚至還可以檢測到單鏈上（另一鏈不含）出現(xiàn)的5hmC（hemi-）。PacBio技術(shù)的獨到之處在于：不單可以區(qū)分5mC 和5hmC，還能識別其位于DNA的哪一條鏈上。 3. 超高測序準確度及單分子分辨率特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定 定向測序中的SNP檢測 高精確，可做稀有SNP的檢測?？梢詸z測多個SNP的單倍體型 ，即兩個臨近的SNP在同一鏈上還是在不同鏈上。由于GC含量不影響單分子測序，片段讀長長，可將靶片段準確定位到參考序列

20、上，加上單分子測序的錯誤隨機，沒有PCR引入的偏向性系統(tǒng)誤差，很容易通過提高覆蓋度得到高準確的的數(shù)據(jù)。Broad研究院經(jīng)過實驗對比得出的結(jié)論，PacBio做SNP檢測假陽性率低，在后續(xù)的SNP驗證上是最好的技術(shù)手段，該論文即將在Nature Methods上發(fā)表，可以先觀看以下Broad在今年的AGBT上的相關(guān)報道視頻： /u/UMTQ2NjcwMTEy/videos 白血病中的突變檢測實例 兩個基因融合突變造成酪氨酸激酶通路產(chǎn)生的失調(diào)。其中一個基因突變會產(chǎn)生二級突變，這種突變會導(dǎo)致病人對激酶抑制劑藥物產(chǎn)生抗藥性。激酶區(qū)域突變有兩種不同方式產(chǎn)生，一種是poly

21、colonal突變，另一種是compound 方式產(chǎn)生。不同的突變方式導(dǎo)致對不同藥物的不同抗藥性。需要有好的方法在臨床上區(qū)分兩種突變產(chǎn)生以個性化用藥。數(shù)天前（4月15日）在Nature發(fā)布的一篇文章。FLT3過去一直被認為是急性髓細胞白血?。ˋML）的有效治療靶標，可患者接受靶向FLT3新藥治療后若復(fù)發(fā)會產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致對FLT3是否真正有效靶標產(chǎn)生質(zhì)疑后來出現(xiàn)很多爭議。 FLT3呈受體結(jié)構(gòu)，有一段激酶區(qū)域，還有一段稱為ITD的重復(fù)序列，ITD上有很多突變，是過去藥物篩選的靶標。這個研究針對ITD突變外部的二級突變與抗藥性的關(guān)系。 研究發(fā)現(xiàn)ITD外部下游區(qū)也有很多二級突變產(chǎn)生，和抗藥性有關(guān)。二級突變產(chǎn)生的頻率很低，很難找到，所以不受重視，在很多研究中，沒有將其與抗藥性關(guān)聯(lián)起來。長度超過1kb。這個長度二代測序是測不到的。傳統(tǒng)Sanger技術(shù)可以了解突變的空間關(guān)系，但處理起來非常麻煩，還需要擴增，挑克隆。PacBio技術(shù)正好可以很容易解決這個問題。結(jié)果表明，在沒用藥前，ITD下游二級突變出現(xiàn)頻率不高，但用藥后二級突變出現(xiàn)頻率升高。8個例子中，不同的病人出現(xiàn)突變的頻率和模式是不同的，其中有的突變頻率很低，不到3%。正是由于第三代測序?qū)﹂L片段及稀有突變的高靈敏度高準確度檢測，重新證