液相色譜分析儀法課件

1、高效液相色譜分析法,一、高效液相色譜儀 HPLC 二、高效液相色譜法的特點(diǎn) feature of HPLC 三、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC 四。固定相和流動(dòng)相,主講:,high performance liquid chromatograph,feature and instrument of HPLC,1,學(xué)習(xí)交流PPT,一、液相色譜儀器 high performance liquid chromatograph,目前常見(jiàn)的HPLC儀生產(chǎn)廠家國(guó)外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國(guó)內(nèi)有大連

2、依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。,2,學(xué)習(xí)交流PPT,液相色譜儀（1） high performance liquid chromatograph,3,學(xué)習(xí)交流PPT,液相色譜儀（2）,4,學(xué)習(xí)交流PPT,液相色譜儀（3）,5,學(xué)習(xí)交流PPT,液相色譜儀（4）,6,學(xué)習(xí)交流PPT,二.概論： 定義：,以液體為流動(dòng)相的色譜法稱為液相色法。用常壓輸送流動(dòng)相的方法為經(jīng)典液相色譜法，這種色譜法的柱效能低、分離周長(zhǎng)。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種色譜方法。與經(jīng)典的液相色譜法相

3、比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點(diǎn)：,7,學(xué)習(xí)交流PPT,1. 應(yīng)用了顆粒極細(xì)（一般為10m以下）規(guī)則均勻的固定相，柱效高，分離效率高； 2. 采用高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，一般試樣的分析需數(shù)分鐘，復(fù)雜試樣分析在數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成； 3. 廣泛使用了高靈敏檢測(cè)器，大大提高了靈敏度。目前，已發(fā)展了多種固定相，有多種不同的分離模式，使高效液相色譜法的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。,8,學(xué)習(xí)交流PPT,.色譜法分類,按兩相的物理狀態(tài)可分為： 氣相色譜法(GC): 適用于分離揮發(fā)性化合物。有機(jī)物質(zhì)中分子量小于400的采用氣相色譜法分析，此范圍的物質(zhì)約占有機(jī)物質(zhì)總數(shù)15%20%. 液相色譜法(LC): 適用于分

4、離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。 分子量為4002000的有機(jī)物質(zhì)可采用液相色譜法分析，而分子量大于2000的則須用凝膠色譜法。,9,學(xué)習(xí)交流PPT,按固定相性質(zhì)及外形分類,柱色譜: 固定相裝在柱管內(nèi)的色譜分析法 紙色譜: 固定相為濾紙的色譜分析法 薄層色譜: 固定相壓成或涂成薄膜的色譜分析法,10,學(xué)習(xí)交流PPT,（三）HPLC的主要分離類型和原理：,高效液相色譜法按分離機(jī)理的不同主要分為四類： 1. 液-固吸附色譜（liquid-solid adsorption chromatography） 固定相：固體吸附劑。如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動(dòng)相：主要是

5、非極性的烴類（如己烷、庚烷）并加入少量極性溶劑作緩和劑（如水、甲醇）。 基本原理：組分在固定相吸附劑表面對(duì)不同物質(zhì)吸附能力不同使混合物分離的；吸附力越強(qiáng),保留時(shí)間越長(zhǎng),反之,保留時(shí)間短,。 適用于分離分子質(zhì)量中等 （2001000 ）的油溶性試樣或極性較小的植物色素等組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，。常用于分離同分異構(gòu)體不適宜于分離強(qiáng)極性的離子型化和物和同系物。 缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾（離子型化合物易產(chǎn)生拖尾）；,11,學(xué)習(xí)交流PPT,2. 液-液分配色譜（liquid- liquid partition chromatography）,固定相與流動(dòng)相均為液體，流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)

6、互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于下式： K= 式中，Cs溶質(zhì)在固定相中濃度；Cm-溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度； 分離的順序取決于K值，在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分保留值大；后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。 在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。,12,學(xué)習(xí)交流PPT,基本原理：

7、組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。 固定相：將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的 液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC); 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反。,13,學(xué)習(xí)交流PPT,正相色譜法：由極性固定相(如氨基與腈基鍵合相)和非極性（或弱極性）流動(dòng)相 (烷烴類如正已烷、環(huán)已烷）所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性

8、硅膠、氰基柱、氨基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷。用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。吸附色譜也屬于正相色譜 反相色譜法；由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的HPLC體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱、 C18、C8 ），代表性的流動(dòng)相是甲醇-水和乙腈-水或水的緩沖液。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式。 適用于分離非極性和極性較弱的化合物。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5（28），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。

9、,14,學(xué)習(xí)交流PPT,液-液分配色譜固定相的液體往往容易溶解到流動(dòng)相中去，所以重現(xiàn)性很差，后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新型固定相-化學(xué)鍵合固定相 。 化學(xué)鍵合固定相：通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將固定液（各種不同基團(tuán)）鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。在HPLC整個(gè)應(yīng)用中占80%以上。 鍵合固定相的載體主要是硅膠，根據(jù)在硅膠表面（具有- Si - OH基團(tuán)）化學(xué)反應(yīng)不同可制成四種鍵合相： （1）硅氧碳型（ SiOC=，硅膠與醇類發(fā)生酯化反應(yīng)）。 （2）硅碳型（ SiC= ，硅膠與鹵代烷反應(yīng)）。 （3）硅氮型（ SiN= ，硅膠與胺類反應(yīng)）。 （4）硅氧烷型（ Si OSiC= ，硅膠與有機(jī)硅烷反應(yīng)）。穩(wěn)定，耐

10、水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣,15,學(xué)習(xí)交流PPT,化學(xué)鍵合色譜與液液分配色譜一樣，也可分為正相和反相色譜。 反相鍵合色譜采用非極性固定相，鍵合的基團(tuán)有C2、C4、C6、C8、C18、C22烷基和苯基。其中最常用的是C18，又稱ODS一十八烷基硅烷鍵合相。所用的流動(dòng)相為極性溶劑，以水為底溶劑,再加入有機(jī)溶劑,最常用的是甲醇-水、乙腈-水和四腈呋喃-水。 正相鍵合色譜采用極性固定相，如氨基、腈基等極性基團(tuán)；非極性或弱極性流動(dòng)相，一般為烴類溶劑，如己烷、庚烷等。,16,學(xué)習(xí)交流PPT,（1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快； （2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、

11、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； （3）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性； （4）有利于梯度洗脫；,化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn),17,學(xué)習(xí)交流PPT,正相色譜法與反相色譜法比較表,正相色譜法 反相色譜法 固定相極性 高中 中低 流動(dòng)相極性 低中 中高 組分洗脫次序 極性小的先洗出 極性大的先洗出 從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒(méi)有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）,18,學(xué)習(xí)交流PPT,3. 離子交換色譜（ion-exchange chromatography）,固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂； 流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固

12、定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)； 陽(yáng)離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應(yīng)用：堿金屬、堿土金屬等離子混合物的分離；食品中添加劑和污染物的分離；生物大分子如氨基酸、核酸等。,19,學(xué)習(xí)交流PPT,4.體積排阻色譜（size- exclusion chromatography）,凝膠(具有一定大小孔隙分布) 固定相：化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、 親水凝膠、無(wú)機(jī)多孔材料,是有一

13、定孔徑的多孔 性填料。 流動(dòng)相： 在凝膠色譜中，流動(dòng)相的作用不是為了控 制分離，而是為了溶解樣品或減小流動(dòng)相粘度。 凝膠過(guò)濾色譜（gel filtration chromatography, GFC）：以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠色譜 法。主要適合于水溶性高分子的分離。 凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography, GPC）： 以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色譜法。 主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四 氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要 用于合成高分子的分子量（分布）的測(cè)定。,20,學(xué)習(xí)交流PPT,基本原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其

14、中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 常用的流動(dòng)相為水、四腈呋喃等 可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在2000以上范圍內(nèi)的化合 物按質(zhì)量分離,如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。,21,學(xué)習(xí)交流PPT,分離類型選擇 choice of separation types,22,學(xué)習(xí)交流PPT,基本概念和術(shù)語(yǔ)：,色譜峰(peak)組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見(jiàn)

15、 色譜圖(chromatogram)樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。 基線(base line)經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。,23,學(xué)習(xí)交流PPT,噪音(noise)基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。 漂移(drift)基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。 拖尾因子(tailing factor，T)T，用以衡量色譜峰的

16、對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子(symmetry factor)或不對(duì)稱因子(asymmetry factor)。中國(guó)藥典規(guī)定T應(yīng)為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。,24,學(xué)習(xí)交流PPT,保留時(shí)間(retention time，tR)從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。 分配系數(shù)(distribution coefficient，K)在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。 K 式中Cs、Cm分別是組分在固定相和流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度。,25,學(xué)習(xí)交流PPT,分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的

17、色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)；離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))；凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來(lái)表示。 理論塔板數(shù)(theoretical plate numberN)用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。,26,學(xué)習(xí)交流PPT,三.高效液相色譜法的特點(diǎn) feature of HPLC,特點(diǎn)：高壓、高效、高速 高靈敏度 流動(dòng)相選擇范圍廣。 是高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。,27,學(xué)習(xí)交流PPT,高壓壓力可達(dá)150420 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。 高速流速為0.110.0 ml/min。 高效可

18、達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。 高靈敏度紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。 流動(dòng)相選擇范圍廣-大部分的有機(jī)溶劑以及水和有機(jī)溶劑的混合物均可用。,28,學(xué)習(xí)交流PPT,四.HPLC的系統(tǒng)組成和工作原理：,（一）系統(tǒng)組成： 高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)五大部分組成。 1. 高壓輸液系統(tǒng)：由 溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表 等組成。 2.進(jìn)樣系統(tǒng)：包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。 3.分離系統(tǒng)：包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。 4.檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器是液相色譜儀的

19、關(guān)鍵部件之一。對(duì)檢測(cè)器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。 5.記錄系統(tǒng)；紀(jì)錄儀、積分儀、色譜工作站,29,學(xué)習(xí)交流PPT,（二）工作原理,儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí), 經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過(guò)程, 各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出, 通過(guò)檢測(cè)器時(shí), 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。,30,學(xué)習(xí)交流PPT,五.流程及主要部件 proce

20、ss and main assembly of HPLC,1.工作流程： 高壓泵將樣品由流動(dòng)相帶入色譜柱分離后，經(jīng)檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并放大，最后以圖譜的形式顯示在工作站熒屏上。,31,學(xué)習(xí)交流PPT,2.主要部件,(1) 高壓輸液泵：有恒流泵和恒壓泵兩種。 主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），當(dāng)液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性,（動(dòng)畫）,32,學(xué)習(xí)交流PPT,泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng),防止任何固體微粒進(jìn)入泵體 :過(guò)濾流動(dòng)相 流動(dòng)

21、相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。否則由于溶液的靜置，可能析出鹽的微細(xì)晶體，損壞密封環(huán)和柱塞等 泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。 輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。 流動(dòng)相必須先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性,33,學(xué)習(xí)交流PPT,(2)梯度淋洗裝置,梯度洗脫就是在分離過(guò)程中使用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。 梯度洗脫

22、裝置分為兩類： 一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度）。 一類是內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯 度）。 相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫 。,34,學(xué)習(xí)交流PPT,內(nèi)梯度（高壓）: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。,外梯度（低壓）: 一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,35,學(xué)習(xí)交流PPT,梯度洗脫裝置是通過(guò)兩個(gè)輸液泵流速的變化，改變流動(dòng)相的洗脫能力，其作用與氣相色譜的程序升溫類似。,A,B,A,B,C,C,36,學(xué)習(xí)交流PPT,(3) 進(jìn)樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)。包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，其作用是

23、將試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣器， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：,37,學(xué)習(xí)交流PPT,六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：,樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45m濾膜過(guò)濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。 轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過(guò)泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞。 為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。,38,學(xué)習(xí)交流PPT,(4) 高效分離柱,色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。 1.構(gòu)造：色譜柱由柱管、壓

24、帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16mm，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 2. 分類：色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類 常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑常用4.6mm，柱長(zhǎng)15或25cm；毛細(xì)管柱（又稱微柱，內(nèi)徑0.20.5mm；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長(zhǎng)1030cm,39,學(xué)習(xí)交流PPT,柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng),1. 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械動(dòng) 2. 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成， 3. 色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖，除去留在柱頭的雜質(zhì)。 4. 選擇適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免

25、固定相被破壞。太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落 5. 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi) 6. 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì) 7. 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。 通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì) 的填料如C18柱，只能在pH29范圍內(nèi)使用。,40,學(xué)習(xí)交流PPT,(5) 液相色譜檢測(cè)器,它是色譜儀的的“眼睛”，是測(cè)量色譜柱流出組分濃度變化的裝置。分為兩類； 1. 通用型檢測(cè)器，它是連續(xù)測(cè)定柱后流出液（流動(dòng)相加溶質(zhì)）總的物理性質(zhì)的變化，如示差折光檢測(cè)器和電導(dǎo)檢測(cè)器； 近年

26、來(lái)出現(xiàn)了新興的通用型檢測(cè)器-蒸發(fā)散射光檢測(cè)器。適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。 2. 選擇性檢測(cè)器（溶質(zhì)性檢測(cè)器），它是測(cè)定流出液中溶質(zhì)（待測(cè)組分）的物理性質(zhì)的變化，對(duì)流動(dòng)相無(wú)信號(hào)，如紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器。目前最常用的主要有紫外-可見(jiàn)光光度檢測(cè)器，熒光光度檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器。,41,學(xué)習(xí)交流PPT,檢測(cè)器的性能指標(biāo): 1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移。 2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過(guò)檢測(cè) 器時(shí)所給出的信號(hào)大小。 3）檢測(cè)限(detection limit) ：指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)

27、（通常用2倍或3倍噪音表示）時(shí)進(jìn)入檢測(cè)器的某組分的量 。 檢測(cè)限是檢測(cè)器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測(cè)器性能越好 4）線性范圍(linear range)：指檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進(jìn)樣量（濃度型檢測(cè)器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比。 。 5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測(cè)器的池體積都小于10l。,42,學(xué)習(xí)交流PPT,a. 紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器,是應(yīng)用最廣的一種選擇性檢測(cè)器，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 作用原理：是待測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外或可見(jiàn)光有選擇性吸收，適合于紫外或可見(jiàn)光區(qū)有吸收的物質(zhì)的測(cè)定。檢測(cè)器輸出信號(hào)的大小即吸光度與待測(cè)組

28、分的濃度之間服從郎伯-比爾定律。 按波長(zhǎng)可分為固定波長(zhǎng)和可變波長(zhǎng)兩類。 固定波長(zhǎng)中用的最多的是UV-254，其次是UV-280，采用低壓汞燈為光源，可檢測(cè)許多有機(jī)化合物。 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器多采用氘燈或鎢燈為光源，提供200800nm范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)的紫外、可見(jiàn)光，可按樣品的吸收特征任意選擇工作波長(zhǎng)。其靈敏度小于固定波長(zhǎng)檢測(cè)器,43,學(xué)習(xí)交流PPT,紫外檢測(cè)器的特點(diǎn)： 靈敏度高（10-9g)； 線性范圍寬(105)； 流通池很?。?mm 10mm 容積 5-8L） 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫 度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。,44,學(xué)習(xí)交流PPT,b. 光電二極管陣列檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器

29、的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,45,學(xué)習(xí)交流PPT,46,學(xué)習(xí)交流PPT,光電二極管陣列檢測(cè)器,47,學(xué)習(xí)交流PPT,c. 示差折光檢測(cè)器（differential refractive index detector）,除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器； 可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；,通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；,48,學(xué)習(xí)交流PPT,示差折光檢測(cè)器,49,學(xué)習(xí)交流PPT,d. 熒

30、光檢測(cè)器（fluorescence detector）,高靈敏度(10-11g)、高選擇性；線性范圍不如UV檢測(cè)器，僅為103。適合于有-共軛體系的大分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜并能產(chǎn)生強(qiáng)熒光的化合物。 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。 其結(jié)構(gòu)和原理與一般的熒光光度儀基本相似，不同處在于其樣品池是一種體積極小和無(wú)液體擾動(dòng)的在線樣品池。,50,學(xué)習(xí)交流PPT,六.固定相和流動(dòng)相, 固定相： 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。 表面多孔型固定相(薄殼型填料) 它的基體是實(shí)心玻璃球，在球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、氧化鋁等

31、。這類固定相出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析。,51,學(xué)習(xí)交流PPT, 全多孔型固定相,由直徑為310nm的全孔硅膠、氧化鋁、硅藻土微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細(xì)（510um），傳質(zhì)速率快，特點(diǎn)是柱效高，分離能力強(qiáng)，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。 化學(xué)鍵和相固定相 它是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型固定相，是用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到載體表面。如烷基（C18、C8）、氨基、氰基等。,52,學(xué)習(xí)交流PPT, 流動(dòng)相,由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親合力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此，正確選擇流動(dòng)

32、相直接影響組分的分離度。 液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。 對(duì)流動(dòng)相溶劑的基本要求是： （1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。 （2）溶劑與檢測(cè)器匹配。 （3）高純度: 有機(jī)溶劑一般為色譜純?cè)噭?，水為高純水。 （4）化學(xué)穩(wěn)定性好 （5）低粘度溶劑，如甲醇、乙腈等。 （6）配好的流動(dòng)相必須超濾（0.45um） （7）使用前還需脫氣（真空、通N2、超聲波）,53,學(xué)習(xí)交流PPT,2. 流動(dòng)相類別,按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 己烷、四氯化碳、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水。 若采用二元

33、或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。,54,學(xué)習(xí)交流PPT,3. 流動(dòng)相選擇,在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小),55,學(xué)習(xí)交流PPT,七. 最常用的色譜定性定量分析方法, 定性分析 在色譜分析中最常用的簡(jiǎn)便可靠的定性方法是用已知物（標(biāo)準(zhǔn)樣）定性法（即保留時(shí)間定性法）。 這個(gè)方法的依據(jù)是：在一定的固定相和一定的操作條件下（如柱長(zhǎng)、柱填料、流速），任何物質(zhì)都有確定的保留值（保留時(shí)間）。測(cè)定時(shí)只要在相同的操作條件下，分別進(jìn)樣，測(cè)定已知物和未知組分的保留值。如果保留值相同，可認(rèn)為是同一化合物。,56,學(xué)習(xí)交流PPT, 定量方法：,歸一化法：指將所有出峰組分的含量之和按100%計(jì)算的定量方法。如果樣品中所有組分都能流出并有響應(yīng)信號(hào)可用此法。 歸一化法的優(yōu)點(diǎn): 簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，不必準(zhǔn)確稱量