胚胎培養(yǎng)ppt課件

1、第一節(jié)體細(xì)胞胚的概念及其發(fā)生途徑第二節(jié)人工種子、體細(xì)胞胚和人工種子第一節(jié)體細(xì)胞胚的概念及其發(fā)生途徑第二節(jié)。體細(xì)胞胚，也稱為胚狀體，是指在體外培養(yǎng)條件下不經(jīng)受精而形成的胚類似物。胚胎發(fā)育圖，1。體細(xì)胞胚的概念。(a)處于伸長階段的合子；合子經(jīng)歷第一次分裂，產(chǎn)生一個頂細(xì)胞(綠色)和一個基細(xì)胞(粉紅色)；四分體胚胎：的頂端細(xì)胞經(jīng)歷兩次縱向分裂，形成具有四個細(xì)胞的胚胎體和具有兩個細(xì)胞的胚胎柄；16細(xì)胞球形胚胎： 8細(xì)胞胚胎的所有細(xì)胞經(jīng)歷一次周裂，產(chǎn)生8細(xì)胞表皮原和8細(xì)胞內(nèi)部組織；(e)早期心形胚胎；心形胚：的子葉和胚根原基已經(jīng)出現(xiàn)；成熟胚胎。1:頂端細(xì)胞；2 :個基底細(xì)胞；3:胚根原細(xì)胞，形成未來的中

2、華民國和根冠的中心區(qū)域；RM:頂端生長點；大量研究表明，在大多數(shù)植物組織培養(yǎng)、單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到了體細(xì)胞胚胎發(fā)生或花粉胚發(fā)生*前者是由二倍體體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體結(jié)構(gòu)* *后者是由單倍體細(xì)胞如小孢子或其分裂產(chǎn)物產(chǎn)生的體細(xì)胞胚，通常稱為花粉胚。5.與器官發(fā)生相比，植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有明顯的特點：1 .兩極性；2.生理隔離；3.相對穩(wěn)定的遺傳；6.2.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的模式* *植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生可分為兩種類型：直接途徑和間接途徑。* *直接方法是從原始外植體直接發(fā)育而不經(jīng)過愈傷組織階段。* *間接方法是從愈傷組織或懸浮細(xì)胞，有時從一組已形成的體細(xì)胞胚發(fā)育體細(xì)胞胚。例如，

3、小蒼蘭的花序外植體通過直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生形成再生植株。7，1途徑直接產(chǎn)生的體細(xì)胞胚的來源細(xì)胞可以是外植體表皮、下表皮、未成熟胚、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體。一般認(rèn)為，直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生是由胚胎發(fā)生細(xì)胞預(yù)先確定的細(xì)胞形成的，這些細(xì)胞最初存在于外植體中，然后直接進(jìn)入胚胎發(fā)生。例如，柑橘的珠心組織(體內(nèi)或體外)是通過預(yù)定細(xì)胞直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最佳例子。在間接體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，外植體的分化細(xì)胞首先去分化，它們的發(fā)育命運被重新確定以誘導(dǎo)胚發(fā)生細(xì)胞來誘導(dǎo)胚決定。將2.0毫克/升2，4-d加入到用于通過莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織的MS培養(yǎng)基中，將2.0毫克/升2，4-d加入到用于胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)和增殖的MS

4、培養(yǎng)基中，將2.0毫克/升2，4-d加入到用于從細(xì)胞聚集體形成體細(xì)胞胚的MS培養(yǎng)基中，并將1.0毫克/升加入到用于體細(xì)胞胚萌發(fā)和植株形成的MS培養(yǎng)基中。9.三.體細(xì)胞胚的起源。* *體細(xì)胞胚胎發(fā)生有直接和間接兩種方式，但無論哪種方式，大多數(shù)研究報道體細(xì)胞胚源于單細(xì)胞，單胚發(fā)生細(xì)胞是從各種植物中觀察到的，包括不均勻分裂的兩細(xì)胞原胚和均勻分裂的兩細(xì)胞原胚、多細(xì)胞原胚和球形胚，直到一些研究認(rèn)為它源于多細(xì)胞。不同發(fā)育階段的許多體細(xì)胞胚可以在同一愈傷組織或胚發(fā)生細(xì)胞復(fù)合體上觀察到，從單個原始細(xì)胞到多細(xì)胞原胚、球形胚、魚雷胚到子葉胚狀體，這是由于體細(xì)胞胚發(fā)生和分裂的不同步造成的。香蕉心形體細(xì)胞胚的單細(xì)胞起

5、源，可可心形胚甲和球形胚乙，甲，乙，1，11，野生胡蘿卜胚狀體甲。心形胚狀體乙。成熟胚狀體丙。早期心形胚狀體丁。兩個成熟胚狀體共享一個胚胎干細(xì)胞，12，*一些學(xué)者觀察到體細(xì)胞胚起源于由多個細(xì)胞組成的胚發(fā)生復(fù)合體。然而，同位素脈沖標(biāo)記實驗可以證明，這些細(xì)胞簇也是由單細(xì)胞連續(xù)分裂形成的，它們在不同的發(fā)育階段被進(jìn)一步分化和分裂形成體細(xì)胞胚，因此這些體細(xì)胞胚也可能來源于單細(xì)胞。當(dāng)然，也不排除有些植物的體細(xì)胞胚真的來源于多種細(xì)胞，這需要進(jìn)一步研究?？傊?，體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一個非常復(fù)雜的生理過程，還有許多問題需要進(jìn)一步研究。2.體細(xì)胞胚的多細(xì)胞起源；13.4.體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚胎發(fā)生細(xì)胞的機制。* *合子胚胎來

6、自受精卵；體細(xì)胞胚是非合子胚，沒有被雄性和雌性配子受精。機制是什么？無論體細(xì)胞胚起源于哪種細(xì)胞，都有一個共同的問題，即體細(xì)胞如何轉(zhuǎn)化為胚胎細(xì)胞形成體細(xì)胞胚。大量研究事實表明，植物細(xì)胞在一定培養(yǎng)條件下具有胚發(fā)生能力可能是一種普遍現(xiàn)象。14，1體細(xì)胞胚胎發(fā)生理論(1)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的本質(zhì)* *體細(xì)胞胚胎發(fā)生的本質(zhì)是細(xì)胞分化的問題，而細(xì)胞分化的分子基礎(chǔ)是基因差異表達(dá)和調(diào)控的結(jié)果。關(guān)于細(xì)胞分化的分子機制有許多理論，其中最普遍的是漸變理論，認(rèn)為細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)因子之間的相互作用是原始穩(wěn)定基因組中基因激活的結(jié)果，從而使細(xì)胞系不同于其他細(xì)胞系。外植體，去分化，愈傷組織，細(xì)胞分化，胚胎發(fā)生細(xì)胞，非胚胎發(fā)生細(xì)胞，基

7、因調(diào)控，15，(2)根據(jù)漸變理論，細(xì)胞分化可分為幾個階段。它可以分為兩個階段：第一階段是預(yù)定階段，細(xì)胞接受或預(yù)定特殊的發(fā)育命運，但不表現(xiàn)出明顯的特化跡象。一旦建立，這種特性可以在細(xì)胞傳代培養(yǎng)中穩(wěn)定地保持。第二階段是表達(dá)階段。在適宜條件的誘導(dǎo)下，預(yù)定細(xì)胞(PEDC)發(fā)生了一系列生理、生化和形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)出分化的特征。然而，由于這種表達(dá)與培養(yǎng)過程中的誘導(dǎo)因素密切相關(guān)，因此是一種不穩(wěn)定的生理反應(yīng)。(3)漸變理論的缺陷(1)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的本質(zhì)以及如何實現(xiàn)細(xì)胞的預(yù)決定沒有被揭示。(2)它不能解釋多次培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)常失去其胚胎發(fā)生能力，因為該理論認(rèn)為預(yù)定細(xì)胞在后期培養(yǎng)過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)。(3)不能解釋體

8、細(xì)胞胚的直接和間接方式因條件不同而相互轉(zhuǎn)化的問題。根據(jù)預(yù)先確定的觀點，直接從外植體組織或細(xì)胞形成體細(xì)胞胚的方法需要合成誘導(dǎo)劑或消除抑制劑以恢復(fù)有絲分裂活性和促進(jìn)胚發(fā)育。這時，生長素經(jīng)常抑制胚胎發(fā)生。當(dāng)生長素被去除并且必要的條件被給予時，細(xì)胞將進(jìn)入分裂周期并表達(dá)胚胎發(fā)生。* *從外植體去分化形成愈傷組織和間接產(chǎn)生體細(xì)胞胚的方法需要分化細(xì)胞的再預(yù)分化，這被稱為誘導(dǎo)胚預(yù)定細(xì)胞(IEDC)。此時，生長素需要誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。生長素不僅是細(xì)胞分裂的必要物質(zhì)，也是細(xì)胞進(jìn)入胚胎狀態(tài)的必要因素。根據(jù)預(yù)先確定的觀點，生長素對體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響有直接和間接兩種方式，17。5.體細(xì)胞胚發(fā)育成植物的能力。體細(xì)胞

9、胚發(fā)育成植株的能力* *一般來說，一旦胚分化，甚至在誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，它們就能成熟并形成小植株。* *例如，陳東方等人(1986年)表明，在體細(xì)胞胚形成后，它可以在原始培養(yǎng)基或不含任何附加成分的MS培養(yǎng)基和含有0.5毫克/升吲哚乙酸或NAA和0.5毫克/升6-BA的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽并形成小植株.18、1。莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織，胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)2.0毫克/升2，4天，胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)2.0毫克/升2，4天，細(xì)胞團(tuán)形成的體細(xì)胞胚2.0毫克/升2，4天，體細(xì)胞胚出芽和植株1.0毫克/升。* *另一種是過早萌發(fā)，即體細(xì)胞胚在顯示完整的胚結(jié)構(gòu)之前已經(jīng)萌發(fā)。在萌發(fā)過程中，盾片膨脹

10、形成葉狀體。注：體細(xì)胞胚途徑的形態(tài)發(fā)生能力長于器官分化途徑。1.基因型和體細(xì)胞胚胎發(fā)生基因型是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的重要因素，每個胚性外植體上體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚的發(fā)生率因基因型而異。(a)不同基因型體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率；不同基因型的每個胚發(fā)生外植體上的體細(xì)胞胚的數(shù)量圖6.7不同基因型的體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)(引用自Miguel等人，2001)，22，2，植物激素和體細(xì)胞胚發(fā)生* *離體植物細(xì)胞通常在開始時缺乏合成生長素和細(xì)胞分裂素的能力，但是在大多數(shù)情況下，生長素和細(xì)胞在這些細(xì)胞的分裂、分化和形態(tài)發(fā)生過程中是必需的。* *在培養(yǎng)基中添加不同種類或不同濃度的外源激素來誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生已被廣泛重視。* *但

11、最重要的是組織和體細(xì)胞胚胎發(fā)生部位中內(nèi)源激素的代謝動力學(xué)和平衡。定義：胚胎培養(yǎng)是指對植物胚胎、子房、胚珠(含胚胎器官)和胚乳進(jìn)行體外培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。范圍：植物胚培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)物的不同外植體，分為胚培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)。胚培養(yǎng)，24、胚培養(yǎng)的意義和類型，克服了遠(yuǎn)緣雜交的不育性，獲得了稀有的雜種植株，打破了種子休眠，縮短了育種周期。許多落葉果樹，尤其是雜交果樹，產(chǎn)生的種子早熟、活力低甚至沒有活力。胚培養(yǎng)能使種子發(fā)芽，提高發(fā)芽率。使生活力低或沒有生活力的種子發(fā)芽。這些植物的種子中含有大量的珠心胚，珠心胚具有很強的生活力，因此往往得不到合子胚，影響雜交育種的結(jié)果。利用胚胎培

12、養(yǎng)可以盡早取出受精卵進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得雜交后代。柑橘類植物的合子胚可以正常發(fā)育。由于被子植物的胚乳細(xì)胞大多是三倍體，通過胚乳培養(yǎng)可以獲得三倍體植株，這使得植物胚培養(yǎng)成為果樹、甜瓜等經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)無籽果實的一種新的育種途徑。e .獲得三倍體或單倍體植株，28，F(xiàn) .快速繁殖特殊植物(椰子、山楂)，g .用于胚胎發(fā)育過程、胚胎發(fā)生條件及影響因素、胚乳生長發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過程的基礎(chǔ)研究。類型：(1)成熟胚培養(yǎng)(2)幼胚培養(yǎng)雙子葉植物胚經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷胚期和子葉期發(fā)育，成為成熟生物。它易于成功培養(yǎng)，在含有無機元素和糖的培養(yǎng)基上能正常生長成苗。由于種子被厚厚的種皮包裹，不易損壞，容易消毒

13、，成熟或未成熟的種子用70%酒精消毒幾秒鐘，然后用無菌水沖洗3-4次，然后在無菌條件下解剖，取出胚接種在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。幼胚是指子葉期之前的幼胚。由于幼胚培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交育種中具有巨大的利用價值，其研究和應(yīng)用越來越深入和廣泛。未成熟胚培養(yǎng)的發(fā)育途徑：胚狀體發(fā)育、早熟萌發(fā)、愈傷組織)，32、(1)材料的選擇和材料的滅菌：大多數(shù)成功的未成熟胚培養(yǎng)案例證明，適合未成熟胚培養(yǎng)的胚發(fā)育時期大多是從球形胚到魚雷形胚。為了挽救幼胚，必須在胚胎退化和衰退之前進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。滅菌：滅菌程序，(a)球形，(b)心形，(c)魚雷形，(2)未成熟胚培養(yǎng)，33、(2)幼胚剝離的成功和剝離胚培養(yǎng)的幼胚是未成熟胚培養(yǎng)成功的

14、關(guān)鍵。幼胚是一種半透明的高粘性組織，在剝離過程中容易失水收縮，因此必須注意保濕，快速操作。對胚胎發(fā)育的細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)研究表明，胚柄積極參與幼胚的發(fā)育，尤其是在球形期前的幼胚培養(yǎng)中，胚柄應(yīng)在胚胎剝離時取出。此外，胚胎干細(xì)胞在體外促進(jìn)未成熟胚胎生長的功能可被濃度為5毫克/升的赤霉素有效替代.未成熟胚培養(yǎng)條件的控制(是否需要特殊處理)剝離的未成熟胚應(yīng)立即接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)前，我們必須充分了解自然發(fā)育條件下培養(yǎng)物的特性，如胚胎的休眠、是否需要春化、胚胎萌發(fā)的溫度等。影響胚胎體外培養(yǎng)的因素?zé)o機鹽胚胎在不同培養(yǎng)基中的成熟度不同，所用培養(yǎng)基的類型也不同。成熟胚的培養(yǎng)基包括土基、白等。未成

15、熟胚胎包括梨狀核、尼奇核、質(zhì)譜等。培養(yǎng)基中碳水化合物的滲透壓對幼胚培養(yǎng)非常重要，滲透壓的調(diào)節(jié)主要取決于糖。蔗糖是常用的。不同發(fā)育階段的胚胎需要不同的蔗糖濃度。胚胎年齡越小，糖濃度越高。確定適宜蔗糖濃度的方法是在接種前將未成熟胚剝離，放入不同濃度的蔗糖溶液中，觀察血漿壁分離現(xiàn)象，從而確定等滲溶液的濃度。附錄：維生素A和維生素A，無論是單一的還是復(fù)合的維生素A都能刺激胚胎生長。Gln是最有效的，Gly，Ala，Glu和Asp是常用的。CH是一種氨基酸類化合物，能抑制過早萌發(fā)，促進(jìn)未成熟胚發(fā)育。維生素通常是早期未成熟胚胎所必需的，但有時它們也有抑制作用，所以最好在實驗證實后使用它們。天然提取物。各種胚乳、酵母抽提物和生長調(diào)節(jié)劑是常用的，38、環(huán)境條件更適合未成熟胚培養(yǎng)，且初期弱光和黑暗。在未成熟胚開始發(fā)育后，給予與其自然光照周期一致的光照條件，有利于其發(fā)育。一般來說，這種植物種子萌發(fā)的適宜溫度是最佳培養(yǎng)溫度。植物培養(yǎng)材料的基因型和胚胎發(fā)育程度對體外胚胎培