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1、第十五章 DNA損傷與修復(fù)遺傳物質(zhì)DNA的遺傳保守性是維持物種相對(duì)穩(wěn)定的最主要因素。然而,在長(zhǎng)期的生命演進(jìn)過程中,生物體時(shí)刻受到來自內(nèi)、外環(huán)境中各種因素的影響,DNA的改變不可避免。各種體內(nèi)外因素所導(dǎo)致的DNA組成與結(jié)構(gòu)的變化稱為DNA損傷(DNA damage)。DNA損傷可產(chǎn)生兩種后果:一是DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生永久性改變,即突變;二是導(dǎo)致DNA失去作為復(fù)制和(或)轉(zhuǎn)錄的模板的功能。在長(zhǎng)期的進(jìn)化中,無論低等生物還是高等生物都形成了自己的DNA修復(fù)系統(tǒng),可隨時(shí)修復(fù)損傷的DNA,恢復(fù)DNA的正常結(jié)構(gòu),保持細(xì)胞的正常功能。DNA損傷的同時(shí)即伴有DNA修復(fù)系統(tǒng)的啟動(dòng)。受損細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸,在很大程度上,取決于
2、DNA的修復(fù)效果,如能正確修復(fù),細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,細(xì)胞得以維持正常狀態(tài);如損傷嚴(yán)重,DNA不能被有效修復(fù),則可能通過凋亡的方式,清除DNA受損的細(xì)胞,降低DNA損傷對(duì)生物體遺傳信息穩(wěn)定性的影響;當(dāng)DNA發(fā)生不完全修復(fù)時(shí),DNA發(fā)生突變,染色體發(fā)生畸變,可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)功能改變,甚至出現(xiàn)衰老、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等生理病理變化。當(dāng)然,如果遺傳物質(zhì)具有絕對(duì)的穩(wěn)定性,那么生物將會(huì)失去進(jìn)化的基礎(chǔ),就不會(huì)呈現(xiàn)大千世界、萬物生輝的自然景象。因此,生物多樣性依賴于DNA突變與DNA修復(fù)之間的良好平衡。第一節(jié) DNA損傷DNA損傷的誘發(fā)因素眾多。一般可分為體內(nèi)因素與體外因素。前者包括機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的某些代謝物
3、,DNA復(fù)制過程中發(fā)生的堿基錯(cuò)配以及DNA本身的熱不穩(wěn)定性等因素,可誘發(fā)DNA的“自發(fā)”損傷。后者包括輻射、化學(xué)毒物、藥物、病毒感染、植物以及微生物的代謝產(chǎn)物等。值得注意的是,體內(nèi)因素與體外因素的作用,有時(shí)是不能截然分開的。許多體外因素是通過誘發(fā)體內(nèi)因素,引發(fā)DNA損傷。然而,不同因素所引發(fā)的DNA損傷的機(jī)制往往是不相同的。一、多種因素通過不同機(jī)制導(dǎo)致DNA損傷(一)體內(nèi)因素1. DNA復(fù)制錯(cuò)誤 在DNA復(fù)制過程中,堿基的異構(gòu)互變、4種dNTP之間濃度的不平衡等均可能引起堿基的錯(cuò)配,即產(chǎn)生非Watson-Crick堿基對(duì)。盡管絕大多數(shù)錯(cuò)配的堿基會(huì)被DNA聚合酶的校對(duì)功能所糾正,但依然不可避免地
4、有極少數(shù)的錯(cuò)配被保留下來,DNA復(fù)制的錯(cuò)配率約10的10次方分之一。此外,復(fù)制錯(cuò)誤還表現(xiàn)為片段的缺失或插人。特別是DNA上的短片段重復(fù)序列,在真核細(xì)胞染色體上廣泛分布,導(dǎo)致DNA復(fù)制系統(tǒng)工作時(shí)可能出現(xiàn)“打滑”現(xiàn)象,使得新生成的DNA上的重復(fù)序列拷貝數(shù)發(fā)生變化。DNA重復(fù)片段在長(zhǎng)度方面有高度多態(tài)性,在遺傳性疾病的研究中有重大價(jià)值。亨廷頓病、脆性X綜合征(fragile X syndrome)、肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良(myotonic dystro-phy)等神經(jīng)退行性疾病均屬于此類。2. DNA自身的不穩(wěn)定性 DNA結(jié)構(gòu)自身的不穩(wěn)定性是DNA自發(fā)性損傷中最頻繁和最重要的因素。當(dāng)DNA受熱或所處環(huán)境的p
5、H值發(fā)生改變時(shí),DNA分子上連接堿基和核糖之間的糖昔鍵可自發(fā)發(fā)生水解,導(dǎo)致堿基的丟失或脫落,其中以脫嘌呤最為普遍。另外,含有氨基的堿基還可能自發(fā)脫氨基反應(yīng),轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N堿基,即堿基的轉(zhuǎn)變,如C轉(zhuǎn)變?yōu)閁, A轉(zhuǎn)變?yōu)镮(次黃嘌298第十五章 DNA損傷與修復(fù) 299呤)等3.機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的活性氧 機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的活性氧(ROS)可以直接作用于堿基,如修飾鳥嘌呤,產(chǎn)生8-羥基脫氧鳥嘌呤等。(二)體外因素最常見的導(dǎo)致DNA損傷的體外因素,主要包括物理因素、化學(xué)因素和生物因素等。這些因素導(dǎo)致DNA損傷的機(jī)制各有特點(diǎn)。1.物理因素 物理因素中最常見的是電磁輻射。根據(jù)作用原理的不同,通常將電磁輻射
6、分為電離輻射和非電離輻射。a粒子、粒子,X射線、射線等,能直接或間接引起被穿透組織發(fā)生電離,屬電離輻射;紫外線和波長(zhǎng)長(zhǎng)于紫外線的電磁輻射屬非電離輻射。(1)電離輻射導(dǎo)致DNA損傷:電離輻射可直接作用于DNA等生物大分子,破壞分子結(jié)構(gòu),如斷裂化學(xué)鍵等。同時(shí),電離輻射還可激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的自由基反應(yīng),因此發(fā)揮間接破壞作用。這些作用最終可導(dǎo)致DNA分子發(fā)生堿基氧化修飾、堿基環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞與脫落、DNA鏈交聯(lián)與斷裂等多種變化。(2)紫外線照射導(dǎo)致DNA損傷:紫外線(ultraviolet,UV)屬非電離輻射。按波長(zhǎng)的不同,紫外線可分為UVA(400一320nm) ,UVB(320一290nm)和UVC(290
7、100nm)3種。UVA的能量較低,一般不造成DNA等大分子損傷。260nm左右的紫外線,其波長(zhǎng)正好在DNA和蛋白質(zhì)的吸收峰附近,容易導(dǎo)致DNA等生物大分子損傷。大氣臭氧層可吸收320nm以下的大部分的紫外線,一般不會(huì)造成地球上生物的損害。但近年來,由于環(huán)境污染,臭氧層的破壞日趨嚴(yán)重,UV對(duì)生物的影響越來越為公眾所關(guān)注。低波長(zhǎng)紫外線的吸收,可使DNA分子中同一條鏈兩相鄰的胸腺嘧啶堿基(T),以共價(jià)鍵連接形成胸腺嘧啶二聚體結(jié)構(gòu)(TT),或稱為環(huán)丁烷型嘧啶二聚體(圖15-1)。紫外線也可導(dǎo)致其他嘧啶間形成類似的二聚體如CT,CC。二聚體的形成可使DNA產(chǎn)生彎曲和扭結(jié),影響DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),使復(fù)制
8、與轉(zhuǎn)錄受阻。另外,紫外線還會(huì)導(dǎo)致DNA鏈間的其他交聯(lián)或鏈的斷裂等損傷。2.化學(xué)因素 能引起DNA損傷的化學(xué)因素種類繁多,主要包括自由基、堿基類似物、堿基修飾物和嵌人染料等。值得注意的是,許多腫瘤化療藥物是通過誘導(dǎo)DNA損傷,包括堿基改變、單鏈或雙鏈DNA斷裂等,阻斷DNA的復(fù)制或RNA的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此,對(duì)DNA損傷及后繼的腫瘤細(xì)胞死亡機(jī)制的認(rèn)識(shí),將十分有助于對(duì)腫瘤化療藥物的改進(jìn)。300 第三篇 遺傳信息的傳遞(1)自由基導(dǎo)致的DNA損傷:自由基是指能夠獨(dú)立存在,外層軌道帶有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或分子。自由基的化學(xué)性質(zhì)異?;钴S,可引發(fā)多種化學(xué)反應(yīng),影響細(xì)胞功能。自由基的產(chǎn)生
9、可以是外界因素與體內(nèi)物質(zhì)相互作用的結(jié)果,如電離輻射產(chǎn)生的羥自由基(OH)和氫自由基(H),而生物體內(nèi)代謝過程可產(chǎn)生活性氧自由基。OH具有極強(qiáng)的氧化性質(zhì),而H則具有極強(qiáng)的還原性質(zhì)。這些自由基可與DNA分子發(fā)生相互作用,導(dǎo)致堿基、核糖、磷酸基的損傷,引發(fā)DNA結(jié)構(gòu)與功能異常。(2)堿基類似物導(dǎo)致的DNA損傷:堿基類似物是人工合成的一類與DNA正常堿基結(jié)構(gòu)類似的化合物,通常被用作促突變劑或抗癌藥物。在DNA復(fù)制時(shí),因結(jié)構(gòu)相似,堿基類似物可取代正常堿基摻人DNA鏈中,并與互補(bǔ)鏈上的堿基配對(duì),進(jìn)而引發(fā)堿基對(duì)的置換。比如,5-溴尿嘧啶(5-bromo uracil,5-BU)是胸腺嘧啶的類似物,有酮式和烯
10、醇式兩種結(jié)構(gòu),前者與腺嘌呤配對(duì),后者與鳥嘌呤配對(duì),可導(dǎo)致AT配對(duì)與GC配對(duì)的相互轉(zhuǎn)變。(3)堿基修飾劑、烷化劑導(dǎo)致的DNA損傷:這是一類通過對(duì)DNA鏈中堿基的某些基團(tuán)進(jìn)行修飾,改變被修飾堿基的配對(duì)性質(zhì),進(jìn)而改變DNA結(jié)構(gòu)的化合物。例如亞硝酸能脫去堿基上的氨基,腺嘌呤脫氨后成為次黃嘌呤,不能與原來的胸腺嘧啶配對(duì),而與胞嘧啶配對(duì);胞嘧啶脫氨基成為尿嘧啶,不能與原來的鳥嘌呤配對(duì),而與腺嘌呤配對(duì),進(jìn)而改變堿基序列。此外,眾多的烷化劑如氮芥、硫芥、二乙基亞硝胺等可導(dǎo)致DNA堿基上的氮原子烷基化,引起分子電荷的變化,從而改變堿基配對(duì),或烷基化的鳥嘌呤脫落形成無堿基位點(diǎn),或引起DNA鏈中的鳥嘌呤連接成二聚體
11、,或?qū)е翫NA鏈交聯(lián)與斷裂。這些變化都可以引起DNA序列或結(jié)構(gòu)的異常,并可阻止正常的修復(fù)過程。(4)嵌人性染料導(dǎo)致的DNA損傷:澳化乙錠、吖啶橙等染料可直接插人到DNA堿基對(duì)中,導(dǎo)致堿基對(duì)間的距離增大一倍,極易造成DNA兩條鏈的錯(cuò)位,在DNA復(fù)制過程中往往引發(fā)核昔酸的缺失、移碼或插人。這些染料在分子生物學(xué)可用于DNA的染色。物理因素和化學(xué)因素造成的DNA損傷的情況如圖15-2所示。3.生物因素 生物因素主要指病毒,如麻疹病毒和真菌等、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、黃曲霉菌等,它們產(chǎn)生的毒素和代謝產(chǎn)物,如黃曲霉素等有誘變作用。第十五章 DNA損傷與修復(fù) 301二、DNA損傷有多種類型DNA分子中的堿基、核
12、糖與磷酸二酯鍵等都是DNA損傷因素作用的靶點(diǎn)。根據(jù)DNA分子結(jié)構(gòu)改變的不同,DNA損傷有堿基脫落、堿基結(jié)構(gòu)破壞、嘧啶二聚體形成、DNA單鏈或雙鏈斷裂、DNA交聯(lián)等多種類型。1.堿基損傷與糖基破壞 化學(xué)毒物可通過對(duì)堿基的某些基團(tuán)進(jìn)行修飾而改變堿基的性質(zhì)。例如,亞硝酸可導(dǎo)致堿基脫氨;在羥自由基的攻擊下,嘧啶堿基易發(fā)生加成、抽氫等反應(yīng),導(dǎo)致堿基環(huán)破裂;具有氧化活性的物質(zhì)可造成DNA中嘌呤和嘧啶堿基的氧化修飾,形成8-羥基脫氧鳥昔或6一甲基尿嘧啶等氧化代謝產(chǎn)物;紫外線作用于DNA分子可形成嘧啶二聚體;糖基的碳原子和羥基上的氫可能與自由基反應(yīng)。由于堿基損傷或糖基破壞,在DNA鏈上可能形成一些不穩(wěn)定點(diǎn),最
13、終可導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。2.堿基之間發(fā)生錯(cuò)配 如前所述,堿基類似物的摻人、堿基修飾劑的作用可改變堿基的性質(zhì),導(dǎo)致DNA序列中的錯(cuò)誤配對(duì)。在正常的DNA復(fù)制過程中,存在著一定比例的自發(fā)堿基錯(cuò)配,最常見的是組成RNA的尿嘧啶替代胸腺嘧啶摻人到DNA分子中。3. DNA鏈發(fā)生斷裂 DNA鏈斷裂是電離輻射致DNA損傷的主要形式。某些化學(xué)毒劑也可導(dǎo)致DNA鏈斷裂。磷酸二酯鍵的斷裂、脫氧戊糖的破壞、堿基的損傷和脫落都是引起DNA斷裂的原因。堿基損傷或糖基破壞可引起DNA雙螺旋局部變性,形成酶敏感性位點(diǎn),特異的核酸內(nèi)切酶能識(shí)別并切割這樣的部位,造成鏈斷裂。DNA鏈上被損傷的堿基也可以被另一種特異的DNA一糖
14、基化酶除去,形成無嘌呤嘧啶位點(diǎn)(apurinic-apyrimidinic site,AP site),或稱無堿基位點(diǎn)(abasic site),這些位點(diǎn)在內(nèi)切酶等的作用下可形成鏈斷裂。DNA斷裂可以發(fā)生在單鏈或雙鏈上,單鏈斷裂能迅速在細(xì)胞中以另一鏈為模板重新合成,完成修復(fù);而雙鏈斷裂在原位修復(fù)的幾率很小,需依賴重組修復(fù),這種修復(fù)導(dǎo)致染色體畸變的可能性很大。因此,一般認(rèn)為雙鏈斷裂的DNA損傷與細(xì)胞的致死性效應(yīng)有直接的聯(lián)系。4. DNA鏈的共價(jià)交聯(lián) DNA損傷中有多種交聯(lián)形式。DNA雙螺旋鏈中的一條鏈上的堿基與另一條鏈上的堿基以共價(jià)鍵結(jié)合,稱為DNA鏈間交聯(lián)(DNA interstrand cr
15、oss-linking)。DNA分子中同一條鏈中的兩個(gè)堿基以共價(jià)鍵結(jié)合,稱為DNA鏈內(nèi)交聯(lián)(DNA intrastrand cross-linking)。DNA分子還可與蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合,稱為DNA一蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA protein cross-link-ing)。紫外線照射后形成的嘧啶二聚體就是DNA鏈內(nèi)交聯(lián)的典型例子。以上分別敘述了各種類型的DNA損傷,實(shí)際上DNA損傷是相當(dāng)復(fù)雜的。當(dāng)DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí),在局部范圍發(fā)生的損傷常不止一種,而是多種類型的損傷復(fù)合存在。最常見的是堿基損傷、糖基破壞和鏈斷裂,這種損傷部位被稱為局部多樣損傷部位。上述DNA損傷可導(dǎo)致DNA模板發(fā)生堿基置換、插入
16、、缺失、鏈的斷裂等變化,并可能影響到染色體的高級(jí)結(jié)構(gòu)。就堿基置換來講,DNA鏈中一種嘌呤被另一種嘌呤取代,或嘧啶被另一種嘧啶取代,稱為轉(zhuǎn)換(transition);嘌呤被嘧啶取代或反之,則稱為顛換(tranaversion)。轉(zhuǎn)換和顛換在DNA復(fù)制時(shí)可引起堿基錯(cuò)配,導(dǎo)致基因突變。堿基的插人和缺失可引起移碼突變。DNA斷裂阻止了RNA合成過程中鏈的延伸。DNA損傷引起的染色體結(jié)構(gòu)變化也可造成轉(zhuǎn)錄,甚至是翻譯的異常。所有這些變化可造成某種或某些基因信息發(fā)生丟失或異常,進(jìn)而導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物的量與質(zhì)的變化,對(duì)細(xì)胞的功能造成不同程度的影響。需要指出的是,由于密碼子的簡(jiǎn)并性(第十七章),上述的堿基置換并非一
17、定發(fā)生氨基酸編碼的改變。堿基置換可以造成改變氨基酸編碼的錯(cuò)義突變(missense mutation)、變?yōu)榻K止密碼子的無義突變(nonsense mutation)和不改變氨基酸編碼的同義突變(same sense mutation)。教科書和文獻(xiàn)中對(duì)于錯(cuò)義突變用氮基酸的單字母符號(hào)和位置共同注明,如B-Raf的第600位的jie氨酸突變?yōu)楣劝彼釀t可寫為V600E,表示為B-RafV600E。302 第三篇 遺傳信息的傳遞第二節(jié) DNA損傷的修復(fù)在長(zhǎng)期的生命活動(dòng)中,生物體發(fā)生DNA損傷是不可避免的。這種損傷所導(dǎo)致的結(jié)局取決于DNA損傷的程度,以及細(xì)胞對(duì)損傷DNA的修復(fù)能力。DNA損傷修復(fù)是指糾
18、正DNA兩條單鏈間錯(cuò)配的堿基、清除DNA鏈上受損的堿基或糖基、恢復(fù)DNA的正常結(jié)構(gòu)的過程。DNA修復(fù)(DNA repair)是機(jī)體維持DNA結(jié)構(gòu)的完整性與穩(wěn)定性,保證生命延續(xù)和物種穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)存在多種修復(fù)DNA損傷的途徑或系統(tǒng)。常見的DNA修復(fù)途徑或系統(tǒng)包括,直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和損傷跨越修復(fù)等(表15-1)。值得注意的是,一種DNA損傷可通過多種途徑來修復(fù),而一種修復(fù)途徑也可同時(shí)參與多種DNA損傷的修復(fù)過程。一、有些DNA損傷可以直接修復(fù)直接修復(fù)是最簡(jiǎn)單的一種DNA損傷的修復(fù)方式。修復(fù)酶直接作用于受損的DNA,將之恢復(fù)為原來的結(jié)構(gòu)。1嘧啶二聚體的直接修復(fù) 嘧啶二聚體的直接修
19、復(fù)又稱為光復(fù)活修復(fù)或光復(fù)活作用。生物體內(nèi)存在著一種光復(fù)活酶(photoreactivating enzyme),能夠直接識(shí)別和結(jié)合于DNA鏈上的嘧啶二聚體部位。在波長(zhǎng)300一500nm的可見光激發(fā)下,光復(fù)活酶可將嘧啶二聚體解聚為原來的單體核苷酸形式,完成修復(fù)(圖15-3)。光復(fù)活酶最初在低等生物中發(fā)現(xiàn)。高等生物雖然也存在光復(fù)活酶,但是光復(fù)活修復(fù)并不是高等生物修復(fù)嘧啶二聚體的主要方式。2.烷基化堿基的直接修復(fù) 催化此類直接修復(fù)的酶是一類特異的烷基轉(zhuǎn)移酶,可以將烷基從核苷酸轉(zhuǎn)移到自身肽鏈上,修復(fù)DNA的同時(shí)自身發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的失活。例如,人類O的6次方一甲基鳥嘌呤一DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,能夠?qū)6位的甲
20、基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上,使甲基化的鳥嘌呤恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)(圖15-4)。3.無嘌呤位點(diǎn)的直接修復(fù) DNA鏈上的嘌呤堿基受損時(shí),可能被糖基化酶水解而脫落,生成無嘌呤位點(diǎn)。DNA嘌呤插人酶能催化游離嘌呤堿基或脫氧核苷與DNA嘌呤缺如部位重新生成糖苷共價(jià)鍵,導(dǎo)致嘌呤堿基的直接插人。這種作用具有很強(qiáng)的專一性。4.單鏈斷裂的直接修復(fù) DNA連接酶能夠催化DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈上缺口處的5一磷酸基團(tuán)與相鄰片段的3一羥基之間形成磷酸二酯鍵,從而直接參與部分DNA單鏈斷裂的修復(fù),如電離輻射所造成的切口。第十五章 DNA損傷與修復(fù) 303二、切除修復(fù)是最普追的DNA損傷修復(fù)方式切除修復(fù)是生物界最普遍的一種
21、DNA修復(fù)方式。通過此修復(fù)方式,可將不正常的堿基或核苷酸除去并替換掉。依據(jù)識(shí)別損傷機(jī)制的不同,又分為堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)兩種類型。1、堿基切除修復(fù)堿基 切除修復(fù)(base excision repair)依賴于生物體內(nèi)存在的一類特異的DNA糖基化酶。整個(gè)修復(fù)過程包括,識(shí)別水解:DNA糖基化酶特異性識(shí)別DNA鏈中已受損的堿基并將其水解去除,產(chǎn)生一個(gè)無堿基位點(diǎn);切除:在此位點(diǎn)的5端,無堿基位點(diǎn)核酸內(nèi)切酶將DNA鏈的磷酸二酯鍵切開,去除剩余的磷酸核糖部分;合成:DNA聚合酶在缺口處以另一條鏈為模板修補(bǔ)合成互補(bǔ)序列;連接:由DNA連接酶將切口重新連接,使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)(圖15一)。腫瘤抑制
22、基因表達(dá)產(chǎn)物p53在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中參與調(diào)控堿基切除修復(fù)。直接證據(jù)是DNA烷化劑誘導(dǎo)的DNA損傷,在表達(dá)野生型TP53的細(xì)胞中可被有效修復(fù),而在TP53缺失的細(xì)胞中修復(fù)速度明顯減慢。304 第三篇 遺傳信息的傳遞2.核苷酸切除修復(fù)與堿基切除修復(fù)不同,核苷酸切除修復(fù)( nucleotide excision repair)系統(tǒng)并不識(shí)別具體的損傷,而是識(shí)別損傷對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)所造成的扭曲,但修復(fù)過程與堿基切除修復(fù)相似。首先,由一個(gè)酶系統(tǒng)識(shí)別DNA損傷部位;其次,在損傷兩側(cè)切開DNA鏈,去除兩個(gè)切口之間的一段受損的寡核苷酸;再次,在DNA聚合酶作用下,以另一條鏈為模板,合成一段新的DNA,填補(bǔ)缺損
23、區(qū);最后,由連接酶連接,完成損傷修復(fù)。切除修復(fù)是DNA損傷修復(fù)的一種普遍形式,它并不局限于某種特殊原因造成的損傷,而能一般性地識(shí)別和糾正DNA鏈及DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的變化,修復(fù)系統(tǒng)能夠使用相同的機(jī)制和一套修復(fù)蛋白去修復(fù)一系列性質(zhì)各異的損傷。遺傳性著色性干皮?。▁eroderma pigmentosum, XP)的發(fā)病,就是由于DNA損傷核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)基因缺陷所致。有關(guān)人類XP相關(guān)的核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)缺陷基因的一般情況,見以下文本框的內(nèi)容,以及表15-2。此外,Cockyne綜合征和人毛發(fā)二硫鍵營(yíng)養(yǎng)不良癥等疾病的遺傳病因也是DNA損傷核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)基因缺陷???5-1遺傳性XP遺傳性XP是
24、由匈牙利裔皮膚科教授M. Kaposi與岳父,于1870年在他們合著的皮膚病教材中最先描述的。XP患者的皮膚對(duì)陽光極度歌感,易受照射損傷,可在幼年時(shí)罹患皮膚癌,同時(shí)伴有智力發(fā)育遲緩,神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等癥狀。J. E. Cleaver等首先發(fā)現(xiàn),XP是由于患者對(duì)紫外線照射造成的皮膚細(xì)胞的DNA損傷的切除修復(fù)缺陷所致。后來經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),XP患者的皮膚細(xì)胞與大鼠的體細(xì)胞融合后所形成的雜種細(xì)胞會(huì)重新獲得DNA損傷切除修復(fù)的能力,從而可幸免于紫外線照射所造成的損傷;而且對(duì)于某些來自于XP患者的成纖維細(xì)胞經(jīng)相互融合后也會(huì)重新獲得上述能力。這些現(xiàn)象提示,XP具有多型性,而且各型之間可相互補(bǔ)償。已
25、有7種互補(bǔ)型(A,B,C,D,E,F,G)被發(fā)現(xiàn),而與之相對(duì)應(yīng)的DNA損傷核苷酸切除修復(fù)缺陷相關(guān)基因分別被命名為XPA,XPB、XPC、XPD、XPE、XPF和XPG等。第十五章 DNA損傷與修復(fù) 305人類的DNA損傷核苷酸切除修復(fù)需要大約30多種蛋白的參與。其修復(fù)過程如下:首先由損傷部位識(shí)別蛋白XPC和XPA等,再加上DNA復(fù)制所需的SSB,結(jié)合在損傷DNA的部位;XPB、XPD發(fā)揮解旋酶的活性,與上述物質(zhì)共同作用在受損DNA周圍形成一個(gè)凸起;XPG與XPF發(fā)生構(gòu)象改變,分別在凸起的3一端和5一端發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性,在增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的幫助下,切除并釋放受損的寡核苷酸;遺留的缺損
26、區(qū)由聚合酶或。進(jìn)行修補(bǔ)合成;最后,由連接酶完成連接。核苷酸切除修復(fù)不僅能夠修復(fù)整個(gè)基因組中的損傷,而且能夠修復(fù)那些正在轉(zhuǎn)錄的基因模板鏈上的損傷,后者又稱為轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)(transcription-coupled repair),因此,更具積極意義。在此修復(fù)中,所不同的是由RNA聚合酶承擔(dān)起識(shí)別損傷部位的任務(wù)。3.堿基錯(cuò)配修復(fù) 錯(cuò)配是指非Watson-Crick堿基配對(duì)。堿基錯(cuò)配修復(fù)也可被看作是堿基切除修復(fù)的一種特殊形式,是維持細(xì)胞中DNA結(jié)構(gòu)完整穩(wěn)定的重要方式,主要負(fù)責(zé)糾正:復(fù)制與重組中出現(xiàn)的堿基配對(duì)錯(cuò)誤;因堿基損傷所致的堿基配對(duì)錯(cuò)誤;堿基插入;堿基缺失。從低等生物到高等生物,均擁有保守的堿基
27、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)或途徑。繼細(xì)菌錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制研究之后,真核細(xì)胞的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制的研究,近年來也取得很大進(jìn)展?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種與大腸桿菌MutS、MutL高度同源的參與錯(cuò)配修復(fù)的蛋白,如與大腸桿菌MutS高度同源的人類的MSH2(MutS Homolog 2)、MSH6、MSH3等。MSH2和MSH6的復(fù)合物可識(shí)別包括堿基錯(cuò)配、插入、缺失等DNA損傷,而由MSH2和MSH3形成的蛋白復(fù)合物則主要識(shí)別堿基的插入與缺失。有關(guān)定位于細(xì)胞核內(nèi)的人類錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)成員的一般情況見表15-3。306 第三篇 遺傳信息的傳遞三、DNA嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)需要重組修復(fù)雙鏈DNA分子中的一條鏈的斷裂,可被模板依賴的DNA合成系統(tǒng)修復(fù),不
28、會(huì)給細(xì)胞帶來嚴(yán)重后果。但DNA分子的雙鏈斷裂是一種極為嚴(yán)重的損傷。與其他修復(fù)方式不同的是,雙鏈斷裂修復(fù)沒有互補(bǔ)鏈提供修復(fù)斷裂的遺傳信息,需要另外一種更為復(fù)雜的機(jī)制,即重組修復(fù)來完成。重組修復(fù)是指依靠重組酶系,將另一段未受損傷的DNA移到損傷部位,提供正確的模板,進(jìn)行修復(fù)的過程。依據(jù)機(jī)制的不同,重組修復(fù)可分為同源重組修復(fù)和非同源末端連接重組修復(fù)。1.同源重組修復(fù) 所謂同源重組修復(fù)(homologous recombination repair) ,指的是參加重組的兩段雙鏈DNA在相當(dāng)長(zhǎng)的范圍內(nèi)序列相同(200bp),這樣就能保證重組后生成的新區(qū)序列正確。大腸桿菌和酵母同源重組的分子機(jī)制已比較清楚
29、,起關(guān)鍵作用的是RecA蛋白,也被稱作重組酶,它是一個(gè)由352個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)分子。多個(gè)RecA單體在DNA上聚集,形成右手螺旋的核蛋白細(xì)絲,細(xì)絲中具有深的螺旋凹槽,可以識(shí)別和容納DNA鏈。在ATP存在的情況下,RecA可與損傷的DNA單鏈區(qū)結(jié)合,使DNA伸展,同時(shí)RecA可識(shí)別一段與受損DNA序列相同的姐妹鏈,并使之與受損DNA鏈并列排列,交叉互補(bǔ),并分別以結(jié)構(gòu)正常的兩條DNA鏈為模板重建損傷鏈。最后在其他酶的作用下,解開交叉互補(bǔ),連接新合成的鏈,完成同源重組(圖15-6)。同源重組生成的新片段具有很高的忠實(shí)性。2.非同源末端連接的重組修復(fù) 非同源末端連接重組修復(fù)( non-homolo
30、gous end joining re-combination repair),是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的一種修復(fù)方式,顧名思義,即兩個(gè)DNA分子的末端不需要同源性就能連接起來。因此,非同源末端連接重組修復(fù)的DNA鏈的同源性不高,修復(fù)的DNA序列中可存在一定的錯(cuò)誤。對(duì)于擁有巨大基因組的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞來說,發(fā)生錯(cuò)誤的位置可能并不在必需基因上,這樣依然可以維持受損細(xì)胞的存活。非同源末端連接重組修復(fù)中起關(guān)鍵作用的蛋白分子是DNA依賴的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK),是一種核內(nèi)的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶,由一個(gè)分子量大約為465 kDa的催化亞基
31、(DNA-PKcs)和一個(gè)能結(jié)合DNA游離端的異二聚體蛋白Ku組成。DNA-PKcs的主要作用是介導(dǎo)DNA-PK的催化功能,Ku蛋白可與雙鏈DNA的斷端連接,促進(jìn)雙鏈斷裂的重接。另一個(gè)參與非同源末端連接重組修復(fù)的重要蛋白是XRCC4(X-ray repair, complementing de-fective,in chinese hamster),它能與DNA連接酶形成復(fù)合物,并增強(qiáng)連接酶的活力,在DNA連接酶與組裝在DNA末端的DNA-PK復(fù)合物相結(jié)合的過程中起中間體作用。非同源末端連接重組修復(fù)既是修復(fù)DNA損傷的一種方式,又可以被看作是一種生理性基因重組策略,將原來并未連在一起的基因或片
32、段連接產(chǎn)生新的組合,如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的受體基因、免疫球蛋白基第十五章 DNA損傷與修復(fù) 307因的構(gòu)建與重排等。四、某些修復(fù)發(fā)生在跨越損傷DNA的復(fù)制事件之后當(dāng)DNA雙鏈發(fā)生大范圍的損傷,DNA損傷部位失去了模板作用,或復(fù)制叉已解開母鏈,致使修復(fù)系統(tǒng)無法通過上述方式進(jìn)行有效修復(fù),細(xì)胞可以誘導(dǎo)一個(gè)或多個(gè)應(yīng)急途徑,跨過損傷部位先進(jìn)行復(fù)制,再設(shè)法修復(fù)。而根據(jù)損傷部位跨越機(jī)制的不同,這種跨越損傷DNA的修復(fù)又被分為重組跨越損傷修復(fù)與合成跨越損傷修復(fù)兩種不同類型。1.重組跨越損傷修復(fù)當(dāng) DNA鏈的損傷較大,致使損傷鏈不能作為模板復(fù)制時(shí),細(xì)胞利用同源重組的方式,將DNA模板進(jìn)行重組交換,使復(fù)制能夠
33、繼續(xù)下去。然而,在大腸桿菌中,還有某些新的機(jī)制,當(dāng)復(fù)制進(jìn)行到損傷部位時(shí),DNA聚合酶III停止移動(dòng),并從模板上脫離下來,然后在損傷部位的下游重新啟動(dòng)復(fù)制,從而在子鏈DNA上產(chǎn)生一個(gè)缺口。RecA重組蛋白將另一股健康母鏈上對(duì)應(yīng)的序列重組到子鏈DNA的缺口處填補(bǔ)。通過重組跨越,解決了有損傷的 DNA分子的復(fù)制問題,但其損傷并沒有真正地被修復(fù),只是轉(zhuǎn)移到了新合成的一個(gè)子代DNA分子上,由細(xì)胞內(nèi)其他修復(fù)系統(tǒng)來后繼修復(fù)或是在不斷復(fù)制之中被“稀釋”掉。2.合成跨越損傷修復(fù) DNA雙鏈發(fā)生大片段、高頻率的損傷時(shí),細(xì)胞可以緊急啟動(dòng)應(yīng)急修復(fù)系統(tǒng),誘導(dǎo)產(chǎn)生新的DNA聚合酶,替換停留在損傷位點(diǎn)的原來的DNA聚合酶,
34、在子鏈上以隨機(jī)方式插入正確或錯(cuò)誤的核苷酸使復(fù)制繼續(xù),越過損傷部位之后,這些新DNA聚合酶完成使命從DNA鏈上脫離,再由原來的DNA聚合酶III繼續(xù)復(fù)制。因?yàn)檎T導(dǎo)產(chǎn)生的這些新的DNA聚合酶的活性低,識(shí)別堿基的精確度差,一般無校對(duì)功能,所以這種合成跨越損傷復(fù)制過程的出錯(cuò)率會(huì)大大增加,是大腸桿菌SOS反應(yīng)或SOS修復(fù)的一部分。308 第三篇 遺傳信息的傳遞在原核細(xì)胞中,SOS修復(fù)反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物的相互作用引發(fā)的,有近30個(gè)“sos”相關(guān)基因編碼蛋白參與此修復(fù)反應(yīng)。正常情況下RecA基因,以及其他的“sos”相關(guān)的可誘導(dǎo)基因的上游,有一段共同的操縱序列(5-CTG-N10-CAG-
35、3)被LexA阻遏蛋白所阻遏抑制,只有低水平的轉(zhuǎn)錄和翻譯,產(chǎn)生少量相應(yīng)蛋白。當(dāng)DNA嚴(yán)重?fù)p傷時(shí),RecA蛋白被激活,促發(fā)LexA的自水解酶活性,當(dāng)LexA阻遏蛋白因水解而從RecA基因,以及“SOS”相關(guān)的可誘導(dǎo)基因的操縱序列上解離下來后,一系列原本受LexA抑制的基因得以表達(dá),參與SOS修復(fù)活動(dòng)。完成修復(fù)后,LexA阻遏蛋白被重新合成,“sos”相關(guān)的可誘導(dǎo)基因又被重新關(guān)閉(圖15-7)。需要指出的是,SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的產(chǎn)物可參與重組修復(fù)、切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)等各種途徑的修復(fù)過程。這種修復(fù)機(jī)制因??站o急呼救信號(hào)“SOS”而得名。此外,對(duì)于受損的DNA分子,除了啟動(dòng)上述諸多的修復(fù)途徑,以修復(fù)損傷之
36、外,細(xì)胞還可以通過其他的途徑將損傷的后果降至最低。例如,通過DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)活化的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)機(jī)制,延遲或阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程,為損傷修復(fù)提供充足的時(shí)間,誘導(dǎo)修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄翻譯,加強(qiáng)損傷的修復(fù),使細(xì)胞能夠安全進(jìn)人新一輪的細(xì)胞周期。與此同時(shí),細(xì)胞還可以激活凋亡機(jī)制,誘導(dǎo)嚴(yán)重受損的細(xì)胞凋亡,在整體上維持生物體基因組的穩(wěn)定。第三節(jié)DNA損傷和修復(fù)的意義遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的世代相傳是維持物種穩(wěn)定的主要因素。但是,如果遺傳物質(zhì)是絕對(duì)一成不變的話,自然界就失去了進(jìn)化的基礎(chǔ),也就沒有新的物種出現(xiàn)。因此生命和生物多樣性依賴第十五章 DNA損傷與修復(fù) 309于DNA損傷或突變與損傷修復(fù)機(jī)制之間的良好動(dòng)態(tài)平衡。一、DN
37、A損傷具有雙重效應(yīng)一般認(rèn)為DNA損傷都是有害的。但是,就DNA損傷的結(jié)果而言,既有消極的一面,也有積極的一面。DNA損傷通常有兩個(gè)生物學(xué)后果:一是給DNA帶來永久性的改變即突變,可能改變基因的編碼序列或者基因的調(diào)控序列;二是DNA的這些改變使得DNA不能用作復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板,使細(xì)胞的功能出現(xiàn)障礙,重則死亡。從長(zhǎng)遠(yuǎn)的生物效應(yīng)來看,進(jìn)化過程是遺傳物質(zhì)不斷突變的結(jié)果??梢哉f沒有突變就沒有如今的生物物種的多樣性。當(dāng)然在短暫的歷史時(shí)期,我們是無法看到一個(gè)物種的自然演變,只能見到長(zhǎng)期突變的累積結(jié)果,適者生存。因此突變是進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。DNA突變可能只是改變基因型,體現(xiàn)為個(gè)體差異,而不影響其基本表型。例如基
38、因的多態(tài)性已被廣泛應(yīng)用于親子鑒定、個(gè)體識(shí)別,器官移植,以及疼病易感性分析等。DNA損傷若發(fā)生在與生命活動(dòng)密切相關(guān)的基因上,可能導(dǎo)致細(xì)胞,甚至是個(gè)體的死亡。人類常利用這種特性來殺死某些病原微生物。DNA突變還是某些遺傳性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。有遺傳傾向的疾病,如高血壓、糖尿病和腫瘤等,均是多種基因與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。二、DNA損傷修復(fù)障礙與腫瘤等多種疾病相關(guān)細(xì)胞中DNA損傷的生物學(xué)后果,主要取決于DNA損傷的程度和細(xì)胞的修復(fù)能力。如果損傷得不到及時(shí)正確的修復(fù),就可能導(dǎo)致細(xì)胞功能的異常。DNA堿基的損傷可導(dǎo)致遺傳密碼子的變化,經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生功能異常的RNA與蛋白,引起細(xì)胞功能的衰退、凋亡,甚至發(fā)
39、生惡性轉(zhuǎn)化。雙鏈DNA的斷裂可通過重組修復(fù)途徑加以修復(fù),但非同源重組修復(fù)的忠實(shí)性差,修復(fù)過程中可能獲得或喪失核昔酸,造成染色體畸變,導(dǎo)致嚴(yán)重后果。DNA交聯(lián)影響染色體的高級(jí)結(jié)構(gòu),影響基因的正常表達(dá),對(duì)細(xì)胞的功能同樣產(chǎn)生影響。因此,DNA損傷與腫瘤、衰老以及免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)(表15-4)。(一)DNA損傷修翅系統(tǒng)缺陷與腫瘤先天性DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)缺陷的人群易患惡性腫瘤。腫瘤發(fā)生是DNA損傷對(duì)機(jī)體的遠(yuǎn)后效應(yīng)之一。眾多研究表明,DNA損傷DNA修復(fù)異常基因突變腫瘤發(fā)生是貫穿腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的重要環(huán)節(jié)。DNA損傷可導(dǎo)致原癌基因的激活,也可使腫瘤抑制基因失活。原癌基因與腫瘤抑制基
40、因的表達(dá)或活性失衡是細(xì)胞惡變的重要機(jī)制。參與DNA修復(fù)的多種基因具有腫310 第三篇 遺傳信息的傳遞瘤抑制基因的功能,目前已發(fā)現(xiàn)這些基因在多種腫瘤中發(fā)生突變而失活。1993年有研究發(fā)現(xiàn),人類遺傳性非息肉性結(jié)腸癌( hereditary non-polyposis colorectal cancer,HNPCC)細(xì)胞存在錯(cuò)配修復(fù)、轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)缺陷,造成細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性,進(jìn)而引起調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)基因的突變,發(fā)生細(xì)胞惡變。在HNPCC中MLH1和MSH2基因的突變時(shí)有發(fā)生。MLH1基因的突變形式主要有錯(cuò)義突變、無義突變、缺失和移碼突變等。而MSH2基因的突變形式主要有移碼突變、無義突變、錯(cuò)義突變以及
41、缺失或插人等;其中以第622位密碼子發(fā)生C/T轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致脯氨酸突變?yōu)榱涟彼嶙顬槌R姡Y(jié)果使MSH2蛋白的功能喪失。BRCA基因(breast cancer gene)參與DNA損傷修復(fù)的啟動(dòng),細(xì)胞周期的調(diào)控。BRCA基因的失活可增加細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性,導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)雙鏈DNA斷裂修復(fù)能力的下降。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BRCA1基因在70%的家族遺傳性乳腺癌和卵巢癌病例中發(fā)生突變而失活。值得注意的是,DNA修復(fù)功能缺陷雖可引起腫瘤的發(fā)生,但已癌變的細(xì)胞本身DNA修復(fù)功能往往并不低下,相反卻顯著地升高,使得癌細(xì)胞能夠充分修復(fù)化療藥物引起的DNA的損傷,這也是大多數(shù)抗癌藥物不能奏效的原因,所以關(guān)于DNA修復(fù)的研究可為腫瘤聯(lián)合化療提供新思路。(二)DNA損傷修復(fù)缺陷與人類遺傳病著色性干皮?。╔P)患者的皮膚對(duì)陽光敏感,照射后出現(xiàn)紅斑、水腫,繼而出現(xiàn)色素沉著、干燥、角化過度,最終甚至?xí)霈F(xiàn)黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀上皮癌及棘狀上皮瘤等瘤變發(fā)生。具有不同臨床表現(xiàn)的XP患者存在明顯的遺傳異質(zhì)性,表現(xiàn)為不同程度的核酸內(nèi)切酶缺乏引發(fā)的切除修復(fù)功能缺陷,所以患者的肺、胃腸道等器官在受到有害環(huán)境因素刺激時(shí),會(huì)有較高的腫瘤發(fā)生率。在對(duì)XP的研究中,還發(fā)現(xiàn)一些患者雖具有明顯的臨
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