分子克隆工具酶-13級.ppt

1、第三章 分子克隆工具酶,第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶 第二節(jié) 甲基化酶 第三節(jié) DNA聚合酶 第四節(jié) 其他分子克隆工具酶,第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶,一、限制與修飾 二、限制酶識別的序列 三、限制酶產(chǎn)生的末端 四、線性DNA末端對酶切的影響 五、酶切反應條件 六、酶切位點的引入,一、限制與修飾,細菌的限制與修飾系統(tǒng)(R/M系統(tǒng)) 由限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶）和修飾酶（甲基化酶）組成。 R / M系統(tǒng)的作用：保護自身的DNA不受切割；破壞外源DNA使之迅速降解。 噬菌體在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率。（見p17） 實驗說明：K菌株和B菌株中存在一種限制作 用，可排除外來的DNA.,限制酶降解外源DNA，維護宿主遺傳穩(wěn)

2、定的保護機制,識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì),AN6-MeA C5-MeC,限制酶的發(fā)現(xiàn) 美國約翰.霍布金斯大學的H.Smith于1970年偶然發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌體DNA，其細胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身DNA，從而找到Hind II限制性內(nèi)切酶。 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。 限制酶的生物學功能 用來保護宿主不受外來DNA的感染，可降解外來的DNA，從而阻止其復制和整合到細

3、胞中。,限制酶的種類 型酶 (種類很少，只占1%) 三亞基雙功能酶，分子量較大，反應需Mg2+、ATP 有特異識別位點但沒有特異切割位點 型酶 (占90%以上) 分子量較小，反應只需Mg2+； 識別位點是一個回文對稱結構，切割位點在回文對稱結構上； 多數(shù)型酶切割DNA后形成粘性末端 型酶 (種類更少，不到1%) 二亞基雙功能酶，能識別特定順序，在該順序的3端2426 bp處切開DNA，切割位點沒有特異性。,限制酶的命名原則 第1個字母：大寫，來自微生物屬名第1個字母 第2和3字母：小寫，來自微生物種名前兩個字母 其它字母：大寫或小寫，來自微生物菌株號 羅馬數(shù)字：該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號 例：E

4、coR I 來源于Escheria coli RY13的第一個限制酶，其識別序列為：GAATTC；,二、限制酶識別的序列,識別序列的長度 一般為48個堿基，最常見的為6個堿基. 4 bp識別序列：Sau3AI GATC 5 bp識別序列：EcoR CCWGG (W=A/T) 6 bp識別序列：EcoR GAATTC 7 bp識別序列：BbvCI CCTCAGC 8 bp識別序列：NotI GCGGCCGC 當DNA中可識別的序列在完全隨機的情況下： 識別序列為4個堿基時，平均每256個(44)堿基中會出現(xiàn)一個識別位點； 識別序列為6個堿基時，平均每4096個(46)堿基中會出現(xiàn)一個識別位點。,

5、識別序列的結構 大多數(shù)為回文對稱結構，切割位點在DNA兩條鏈相對稱的位置。 限制酶切割的位置 大多數(shù)在識別序列的內(nèi)部，如EcoRI、SmaI等； 但也有在外部的：有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之分，如Sau3AI (GATC)。,三、限制酶產(chǎn)生的末端,限制酶產(chǎn)生黏性末端 在對稱軸5側(cè)切割底物，DNA雙鏈交錯斷開產(chǎn)生5突出黏性末端，如 EcoR I； 在3側(cè)切割，則產(chǎn)生3突出黏性末端，如Pst I；,限制酶產(chǎn)生平末端 在回文對稱軸上同時切割DNA兩條鏈，產(chǎn)生平末端，如Hpa。 限制酶產(chǎn)生非對稱突出末端 當識別序列為非對稱序列時，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的，如BbvC的識別切割位點如下： CCTCAGC

6、GGAGTCG,同裂酶：識別相同序列的限制酶稱為同裂酶。 同序同切酶：識別序列和切割位置都相同 Hpa與Msp識別切割位點為CCGG Mob與Sau3A識別切割位點為GATC 同序異切酶：識別序列相同，但切割位點不同 Kpn：GGTACC Acc65：G GTACC “同工多位”酶：識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。 EcoR I：GAATTC Apo I: RAATTY (R=A/G Y=C/T),同尾酶 可產(chǎn)生相同的黏性突出末端的酶統(tǒng)稱為同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進行互補連接。 EcoR： GAATTC Apo I: RAATTY Mfe I: CAATTC 稀切酶

7、 有較長的識別序列和富含GC或AT的識別序列的限制酶稱為稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以獲得大的片段。,四、線性DNA末端對酶切的影響,DNA末端長度的影響 限制酶切割DNA時，識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則難以發(fā)揮切割活性。 一般在識別序列末端有3 4個堿基對時能滿足常規(guī)的酶切需要。,位點偏愛(site preference) 某些限制酶對不同位置的同一識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率，這種現(xiàn)象稱作位點偏愛。 pBR322質(zhì)粒上有4個Nar位點，在標準條件下1單位Nar可在1h內(nèi)將2個位點完全切割，但另外2個位點在50單位16h內(nèi)也不能切割完全。 造成位點偏愛的原因 在切割DNA之

8、前需要同時與2個識別位點作用； 在要切割的DNA序列上有兩個明顯不同的結合位點，其中一個是為DNA切割時激活另一個的變構位點。,五、酶切反應條件,緩沖液 包括Tris-HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白) 限制酶緩沖液按離子強度的差異分為高、中、低3種類型 H Buffer (100 mM NaCl)； M Buffer (50 mM)； L Buffer (0 mM) 反應溫度：大多數(shù)為37 反應時間：通常為1h或更多 終止酶切的方法： 10 mM EDTA；加熱失活；苯酚抽提除去蛋白質(zhì),星星活性 在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。

9、 引起星星活性的原因 甘油濃度高（5%） 酶過量（100 U/l ） 離子強度低（25 mM） pH值過高（8.0 ） 加了有機溶劑，如乙醇等 降低星星活性的措施 減少甘油濃度；減少酶用量；中性pH；提高鹽濃度；反應體系中無有機溶劑；保證使用Mg2+作為2價陽離子,六、酶切位點的引入,將產(chǎn)生的5突出末端補平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點 同尾末端的連接 平末端連接,第二節(jié) 甲基化酶,甲基化酶 (methylase) 的概念 甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應的限制酶所切割。 甲基化酶與對應的限制酶識別相同的序列，在兩條鏈上對某個堿基進行甲基化。,甲基化酶的種類 在E

10、.coli中，大多數(shù)都有3個位點特異性的DNA甲基化酶 Dam甲基化酶 可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基 當需要在敏感位點上完全切割DNA時，可利用dam- E.coli擴增并提取DNA Dcm甲基化酶 識別CCAGG或CCTGG序列，在第二個胞嘧啶C 的C5位置上引入甲基 EcoK甲基化酶 識別AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中A的N6位置,甲基化對限制酶切的影響 修飾酶切位點 Hinc可識別序列GTCGAC，甲基化酶 M.Taq可甲基化 TCGA中的A ，M.Taq處理DNA后，GTCGAC 將不受 Hinc切割 產(chǎn)生新的酶切位點 Dpn是依賴甲基化的限制

11、酶，TCGATCGA 受 M.Taq處理后形成甲基化(A)產(chǎn)物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即為 Dpn位點。 對基因組作圖的影響,第三節(jié) DNA聚合酶,一、大腸桿菌DNA聚合酶 二、Klenow DNA聚合酶 三、T4噬菌體DNA聚合酶 四、T7噬菌體DNA聚合酶 五、耐熱DNA聚合酶 六、反轉(zhuǎn)錄酶 七、末端轉(zhuǎn)移酶,DNA聚合酶 (DNA polymerase) 的概念 催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下)及其相輔的活性。 原核細胞有3種DNA聚合酶 DNA聚合酶：催化單鏈或雙鏈DNA的延長 DNA聚合酶：與低分子DNA鏈的延長有關 DNA聚合酶：促進DNA

12、鏈延長的主要酶,大腸桿菌DNA聚合酶 功能 53DNA聚合酶活性 53外切核酸酶活性 35外切核酸酶活性 用途 在沒有dNTP的情況下，外切活性占主導地位； 當存在足夠的dNTP時，外切活性和合成活性處在動態(tài)平衡中，結果使得雙鏈DNA成為平末端。 利用53外切核酸酶活性,可用切口平移法標記DNA。,切口平移法標記DNA，制備分子雜交探針,KlenowDNA聚合酶 由E.coli DNA聚合酶經(jīng)蛋白酶裂解后，除去53外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性 用途 補平DNA的3凹端 抹平DNA的3凸端 通過置換反應對DNA進行末端標記 隨機引物標記,T4

13、噬菌體DNA聚合酶 從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出來的一種特殊的DNA聚合酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性（200倍） 用途 35外切核酸酶活性強，且不從單鏈DNA模板上替換引物。在誘變反應中可提高誘變率近一倍。,T7噬菌體DNA聚合酶 來源于T7噬菌體感染的大腸桿菌，是由兩種緊密結合的蛋白質(zhì)形成的復合體。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性（1000倍） 應用 DNA聚合能力強，可用于長模板的引物延伸，在DNA測序中有優(yōu)勢。,耐熱DNA聚合酶 指在高溫下具有活性的DNA聚合酶，來自嗜高溫的細菌，主要用于PCR反應。 Taq DNA聚合酶 Vent D

14、NA聚合酶 PfuDNA聚合酶 PwoDNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 即依賴于RNA的DNA聚合酶，有53合成DNA活性，但是無 35外切核酸酶活性。 禽成髓細胞瘤病毒（AMV） 包含兩條多肽鏈，具 53DNA聚合酶活性和很強的RNaseH活性，在42能有效發(fā)揮作用。 Moloney鼠白血病病毒（M-MuLV） 單鏈多肽，其RNaseH活性弱，有利于合成較長的cDNA 用途：以mRNA為模板合成cDNA ；5突出DNA的補平和標記；DNA測序等。,末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 來源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。 在

15、Co2+/Mg2+存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3-OH端。 作用 標記DNA的3末端 在cDNA或載體3末端加同聚尾，便于克隆。,第四節(jié) 其他分子克隆工具酶,一、依賴于DNA的RNA聚合酶 二、連接酶 三、T4多核苷酸激酶 四、堿性磷酸酶 五、核酸酶,一、依賴于DNA的RNA聚合酶,活性 即轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識別DNA中各自特異的啟動子序列，并沿此DNA模板起始RNA的合成。 聚合反應時，無需引物，但需識別特異性位點。 類型 SP6噬菌體RNA聚合酶 (來源于感染鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株) T4噬菌體RNA聚合酶 T7噬菌體RNA聚合酶 (來源于噬菌體感染的大腸桿菌) 應

16、用：體外合成RNA分子、表達外源基因。,二、連接酶(ligase),連接酶就是將兩段核酸連接起來的酶，相當于基因工程中的“糨糊”。 連接酶的種類 T4 DNA連接酶 (16反應) 活性：催化DNA 5-P與3-OH之間形成磷酸二酯鍵。 反應底物：黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA連接 大腸桿菌DNA連接酶：平末端連接效率低。 Taq DNA連接酶 (4565反應) 連接雙鏈DNA中的缺口，不能代替T4 DNA連接酶。 T4 RNA連接酶,黏性末端DNA片段的連接,三、T4 多核苷酸激酶,T4多核苷酸激酶是一種磷酸化酶，可將ATP的-磷酸基團轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5末端。 分子克隆中呈

17、現(xiàn)2種反應 將ATP的-磷酸基團轉(zhuǎn)移到無磷酸的DNA5末端 在過量ATP存在的情況下，可將DNA的5-P轉(zhuǎn)移給ADP，然后DNA從ATP中獲得-磷酸而重新磷酸化。 應用 對缺乏5-P的DNA進行磷酸化 對DNA末端進行放射性標記（-32P-ATP）。,四、堿性磷酸酶,堿性磷酸酶是一類能催化除去DNA或RNA分子的5 磷酸，使末端轉(zhuǎn)換成5 -OH的酶。 類型 牛小腸堿性磷酸酶（CIAP） 細菌堿性磷酸酶 (BAP) 蝦堿性磷酸酶 (SAP) 用途 去除5-P，防止DNA片段自身連接 標記(5端)前去除DNA或RNA的5-P,如何解決質(zhì)粒自身連接？,五、核酸酶,BAL31核酸酶 具有3外切核酸酶活

18、性，可從線性DNA兩條鏈的3端迅速去除單核苷酸。 用途 從兩頭縮短DNA，用于構建嵌套缺失體；制作DNA限制酶切圖。 S1核酸酶 一種單鏈核酸酶，降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶 5-P的單核苷酸或寡核苷酸雙鏈。 用途 DNA黏性末端變?yōu)槠侥┒耍蜷_雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。,核糖核酸酶A (RNase A) 內(nèi)切核酸酶，特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3端。 用途 去除DNA樣品中的RNA 核糖核酸酶H (RNaseH) 內(nèi)切核酸酶，特異性水解與DNA雜交的RNA上的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生帶有3-OH和5-P末端的產(chǎn)物，不降解單鏈核酸、dsDNA或dsRNA. 用途 在cDNA克隆合成第二鏈之前去除RNA,脫氧核糖核酸酶(DNase) 來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA. 用途 去除RNA樣品中的DNA 切口平移標記時在dsDNA上產(chǎn)生隨機切口 外切核酸酶 (exonuclease) 催化從dsDNA 3-OH