檸檬酸、谷氨酸發(fā)酵機(jī)制

1、一、檸檬酸簡(jiǎn)介,檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一?；瘜W(xué)名稱2-羥基丙三羧酸，英文文獻(xiàn)俗名citric acid，分子式C6H8O7。無(wú)色或白色晶體，無(wú)臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應(yīng)。,第一節(jié) 概述,第四章 檸檬酸發(fā)酵機(jī)制,食品工業(yè)：主要作為飲品的酸味劑，用于各種清涼飲料，還有汽水、糖果、餅干、罐頭、果醬、果汁等食品的制造。 也可用作油脂的抗氧劑； 醫(yī)藥工業(yè)：是許多醫(yī)藥品的原材料，如檸檬酸哌吡嗪（驅(qū)蛔蟲(chóng)藥）、檸檬酸鐵銨（補(bǔ)血?jiǎng)?、檸檬酸鈉（輸血?jiǎng)┑?。此外，檸檬酸還用在許多醫(yī)藥中做酸化劑； 化學(xué)工業(yè)：檸檬酸的酯類可以作為無(wú)毒增塑劑，來(lái)制造

2、食品包裝的塑料薄膜； 其它方面，如用于工業(yè)、民用的洗滌劑中作為助劑，制造無(wú)公害洗滌劑；用在混凝土中作緩凝劑；在電鍍中、皮革業(yè)、油墨、曬圖等工業(yè)中也被得到廣泛應(yīng)用。,二、檸檬酸的應(yīng)用概況,三、我國(guó)檸檬酸生產(chǎn)現(xiàn)狀,生產(chǎn)狀況： 60年代開(kāi)始，生產(chǎn)檸檬酸年總產(chǎn)量居世界第一，出口量一直占國(guó)內(nèi)總產(chǎn)量的50%以上。目前，生產(chǎn)廠家近百家，萬(wàn)噸級(jí)以上的有6家。主要有安徽豐原生物化學(xué)集團(tuán)公司（生產(chǎn)能力為12.0萬(wàn)噸/年）、江蘇無(wú)錫羅氏中亞檸檬酸有限公司（生產(chǎn)能力為4.0萬(wàn)噸/年）、安徽華源生物藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)能力為3.5萬(wàn)噸/年）等。 存在問(wèn)題：出口量增長(zhǎng)過(guò)快，技術(shù)創(chuàng)新相對(duì)滯后，加上國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈，已出現(xiàn)嚴(yán)重

3、的供大于求的局面，設(shè)備利用率不到60%，行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益呈滑坡態(tài)勢(shì)。,第二節(jié) 檸檬酸合成途徑與代謝調(diào)控,1940年，Krebs: TCA； 1953年，Jagnnathan證實(shí)黑曲霉中存在EMP途徑所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖80%經(jīng)EMP途徑代謝； 1954-1955年，Ramakrishman等發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在TCA循環(huán)。,一、檸檬酸合成途徑的發(fā)現(xiàn),二、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑,黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經(jīng)EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)CO2固定化反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。,(1)

4、生長(zhǎng)期與產(chǎn)酸期都存在EMP與HMP途徑，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1,(2)黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中存在TCA循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，在以糖質(zhì)原料發(fā)酵，當(dāng)檸檬酸積累時(shí)，TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱。,(3)由于TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由兩個(gè)CO2固定化反應(yīng)體系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸為主。,三、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制,1、磷酸果糖激酶（PFK）：,（一）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié),Mn2+濃度對(duì)磷酸果糖激酶的影響,Mn2+ 缺乏為何會(huì)使NH4+濃度升高呢？,當(dāng)培養(yǎng)基中M

5、n2+ 缺乏時(shí)，微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA、GLu、Arg、Gln等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會(huì)升高。,磷酸果糖激酶（PFK）的調(diào)節(jié), 檸檬酸和ATP對(duì)該酶有抑制,生產(chǎn)菌需要解除該抑制作用,AMP、無(wú)機(jī)磷以及NH4+對(duì)該酶有活化作用,NH4+有效解除檸檬酸和ATP對(duì)該酶有抑制 ，故生產(chǎn)上通過(guò)添加銨鹽來(lái)提高檸檬酸產(chǎn)量, Mn2+的影響：,Mn2+缺乏,菌體的TCA酶活下降,Mn2+缺乏,可能干擾蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解,NH4+水平升高,減少檸檬酸對(duì)該酶的抑制,2、CO2固定反應(yīng),通過(guò) CO2

6、固定反應(yīng)提供C4二羧酸 （1）磷酸烯醇式丙酮酸 + CO2 = 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 （2）丙酮酸 + CO2 = 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：丙酮酸羧化酶 以上兩種CO2固定反應(yīng)所需要的輔酶都是生物素。 草酰乙酸的積累利于加速檸檬酸合成,（二）三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié),1、檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)：檸檬酸合成酶是TCA循環(huán)第一個(gè)酶。但黑曲霉中檸檬酸合成酶沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。,2、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)：,順烏頭酸水合酶、NAD和NADP-異檸檬酸脫氫酶在檸檬酸產(chǎn)生與不產(chǎn)生時(shí)，這3種酶均存在（組成酶）；而控制銅離子0.3mg/L，鐵離子2mg/L和pH2.0情況下，這3

7、種酶均不出現(xiàn)活力。,順烏頭酸水合酶是催化檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸可逆反應(yīng)。研究表明，黑曲霉中有一種單純的位于線粒體上的順烏頭酸水合酶，它在催化時(shí)能建立下面的平衡：檸檬酸:順烏頭酸:異檸檬酸90:3:7。鐵為順烏頭酸酶的激活劑，,3、-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié),在黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中，TCA循環(huán)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，-酮戊二酸脫氫酶的合成受葡萄糖和銨離子的阻遏。因此當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，在檸檬酸生成期，菌體內(nèi)不存在-酮戊二酸脫氫酶或活力很低。,-酮戊二酸脫氫酶催化的反應(yīng)是TCA循環(huán)中唯一不可逆反應(yīng)，一旦-酮戊二酸脫氫酶喪失，就會(huì)引起：TCA循環(huán)中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循環(huán)生成，使TCA

8、循環(huán)成“馬蹄形”。-酮戊二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。,菌體要大量合成檸檬酸，從葡萄糖經(jīng)過(guò)EMP到檸檬酸整個(gè)代謝途徑需要暢通，在這個(gè)過(guò)程中：丙酮酸氧化脫羧，每分子丙酮酸可產(chǎn)生一分子的NADH，在有氧的條件下，每分子的NADH經(jīng)過(guò)呼吸鏈徹底氧化成H2O，并氧化磷酸化產(chǎn)生3分子的ATP，造成了微生物體內(nèi)能荷的增加，能荷增加則抑制PFK等關(guān)鍵酶的酶活性，使得從葡萄糖到檸檬酸的代謝停止。,（三）能荷調(diào)節(jié)對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響,如果NADH（還原型）不能夠快速的被氧化轉(zhuǎn)變成NAD（氧化型），則整個(gè)反應(yīng)就會(huì)因?yàn)槿狈ψ鳛橥苿?dòng)力的氧化型的NAD而停止，仍然不能夠合成檸檬酸。,檸檬酸產(chǎn)生菌可在有氧的條件下大量生成

9、檸檬酸，也就是說(shuō)，NADH即被氧化了，又沒(méi)有產(chǎn)生ATP。,解偶聯(lián)劑（uncoupler）,使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進(jìn)行，而磷酸化不能進(jìn)行，解偶聯(lián)劑為離子載體或通道，能增大線粒體內(nèi)膜對(duì)H+的通透性，消除H+梯度，因而無(wú)ATP生成，使氧化釋放出來(lái)的能量全部以熱的形式散發(fā)。常用解偶聯(lián)劑主要有： 質(zhì)子載體： 2，4-二硝基酚(DNP)，羰基-氰-對(duì)-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。 質(zhì)子通道：增溫素（thermogenin）。 其它離子載體：如纈氨霉素。 某些藥物：如過(guò)量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯(lián)，從而使體溫升高。,一種假設(shè)：該菌體內(nèi)存在一條側(cè)系呼吸鏈，NAD(P)H經(jīng)過(guò)該呼吸鏈，可以正常

10、的傳遞H+，將其氧化為H2O，但是并沒(méi)有氧化磷酸化生成ATP；能夠正常產(chǎn)生ATP的呼吸鏈稱之為標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈。,實(shí)驗(yàn)證明，在某些微生物體內(nèi)確實(shí)存在側(cè)系呼吸鏈，該側(cè)系呼吸鏈中的酶系強(qiáng)烈需氧，如在檸檬酸的發(fā)酵中，發(fā)酵液的溶氧濃度在很低水平維持一段時(shí)間，或中斷供氧一段時(shí)間（20分鐘），則這一側(cè)系呼吸鏈不可逆的失活，其結(jié)果是菌體不再產(chǎn)酸，而是產(chǎn)生了大量的菌體。,（四）乙醛酸循環(huán)和醋酸發(fā)酵檸檬酸,丙酮酸脫羧反應(yīng)是不可逆的，存在異檸檬酸裂解酶，草酰乙酸的供給只能由乙醛酸循環(huán)來(lái)完成,3醋酸 1檸檬酸 生成的檸檬酸一半轉(zhuǎn)化為異檸檬酸 順烏頭酸水合酶催化反應(yīng)平衡為：檸檬酸：異檸檬酸：順烏頭酸 = 90：7：3。細(xì)胞

11、質(zhì)中積累大量異檸檬酸。,Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4+，有一條呼吸活動(dòng)強(qiáng)的不產(chǎn)生ATP的側(cè)呼吸鏈：解除磷酸果糖激酶的代謝調(diào)節(jié)，促進(jìn)EMP途徑暢通。 丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控制。丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA和CO2的固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸檬酸的能力。,小結(jié)：,順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立了以下平衡： 檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7 同時(shí)控制Fe2+含量時(shí)，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。 隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時(shí)，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累。,（五）檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率,1、無(wú)CO2固定反應(yīng)的產(chǎn)率,合成

12、1分子檸檬酸需要3分子乙酰輔酶A，也就是需要1.5分子的葡萄糖。,理論產(chǎn)率為： 192 /( 1801.5) = 71.1%,2、通過(guò) CO2固定反應(yīng)提供C4二羧酸,四、檸檬酸發(fā)酵過(guò)程的控制要點(diǎn),（1）控制Mn2+、NH4+濃度，解除檸檬酸對(duì)PFK的抑制，使EMP暢通無(wú)阻。,（4）控制培養(yǎng)基中的Fe2+ 的濃度及產(chǎn)酸發(fā)酵的pH，使順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶失活。,（2）控制溶氧，防止側(cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ睢?（3）篩選丙酮酸羧化酶高活性菌株，培養(yǎng)基生物素含量充足，提高CO2固定合成草酰乙酸能力,檸檬酸發(fā)酵中，三個(gè)控制點(diǎn),五、檸檬酸產(chǎn)生菌育種的傳統(tǒng)方法：,1. 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 +

13、2 %的瓊脂 + 0.5% CaCO3 誘變后，涂布，透明圈大的則好 2. 顯色圈大小 平板：麥汁培養(yǎng)基 + pH值指示劑 誘變后，33培養(yǎng)3天，變色圈大的則好。,3. 不分解檸檬酸的菌株 不利用檸檬酸為碳源的菌株，說(shuō)明其TCA循環(huán)中檸檬酸后續(xù)酶的活性較低，或者喪失，這有利于積累檸檬酸。方法：以檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不好的突變株。 4. 選育不長(zhǎng)孢子、少長(zhǎng)孢子、遲長(zhǎng)孢子的菌株 在培養(yǎng)基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會(huì)使TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物濃度降低，這樣不利于孢子的形成。 （中間產(chǎn)物少，C架少，不利于合成代謝，不利于孢子的形成）,第五章 氨基酸發(fā)酵機(jī)制 （谷氨酸發(fā)酵）,一、概

14、述,在食品工業(yè)上的應(yīng)用。甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸鈉、天冬氨酸鈉具有鮮味，可用作食品添加劑。蛋氨酸、賴氨酸、谷氨酸鈉、甘氨酸、丙氨酸和蘇氨酸目前作為飼料添加劑。 在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用。氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉劑可作宇航員、飛行員的補(bǔ)品。精氨酸藥物用于治療由氨中毒造成的肝昏迷；絲氨酸藥物用作疲勞回復(fù)劑；蛋氨酸、胱氨酸用于治療脂肪肝；L谷氨酸與L谷氨酰胺用于治療腦出血后的記憶力障礙等。 在化妝品生產(chǎn)中的應(yīng)用。氨基酸及其衍生物與皮膚的成分相似，具有調(diào)節(jié)皮膚pH和保護(hù)皮膚的功能。胱氨酸用于護(hù)發(fā)素中，絲氨酸用于面霜中。谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸與脂肪酸形成的表

15、面活性劑，具有清洗、抗菌等功能，用于護(hù)膚品、洗發(fā)劑。 在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。一些氨基酸在體外并無(wú)殺菌功能，但能干擾植物與病原菌之間的生化關(guān)系，使植物的代謝及抗病能力發(fā)生變化，從而達(dá)到抑菌的目的。苯丙氨酸和丙氨酸可用于治療蘋果瘡痂病。用甘氨酸制成了除草劑，易被微生物分解，不會(huì)造成環(huán)境污染。,氨基酸的制備方法,發(fā)酵法：發(fā)酵法又可分為直接發(fā)酵法與添加前體的發(fā)酵法。添加前體法是以氨基酸的中間產(chǎn)物為原料，用微生物法轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基酸。 提取法：將蛋白質(zhì)原料用酸水解，然后從水解液中提取氨基酸。目前，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生產(chǎn)。 酶法：利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶來(lái)制造氨基酸。 合成法：用化學(xué)合成法

16、制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。,二、氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn),氨基酸本身的合成在不同生物體中，有較大的差異，然而許多氨基酸的合成途徑在不同生物體中也有共同之處。 按照起始物可將氨基酸的合成分成幾個(gè)家族： 谷氨酸族（-酮戊二酸族） 包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸； 丙酮酸族 包括：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸； 天冬氨酸族（草酰乙酸族） 包括：天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和異亮氨酸； 磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸； 芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸； 組氨酸 合成為單獨(dú)的一條途徑。,部分氨基酸及其生產(chǎn)所用菌株,氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵 氨

17、基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵。由發(fā)酵所生成的產(chǎn)物氨基酸，都是微生物的中間代謝產(chǎn)物，它的積累的關(guān)鍵是取決于是否能打破微生物的正常代謝調(diào)節(jié)。,控制旁路代謝 降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛龋嚎刂品答佔(zhàn)饔梦餄舛仁强朔答佉种坪妥瓒簦拱被岬纳锖铣煞磻?yīng)能順利進(jìn)行的一種手段 消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏：通過(guò)使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法來(lái)進(jìn)行 控制細(xì)胞滲透性 控制發(fā)酵環(huán)境 促進(jìn)ATP的積累，以利于氨基酸的生物合成,D-蘇氨酸,L-蘇氨酸,-酮基丁酸,L-異亮氨酸,L-蘇氨酸 脫氫酶,反饋抑制,D-蘇氨酸 脫氫酶,谷氨酸,N-乙酰谷氨酸,N-乙酰-谷氨酰磷酸,N-乙酰谷氨酸-半醛,N-乙酰鳥(niǎo)氨酸,鳥(niǎo)氨酸,瓜氨

18、酸,精胺琥珀酸,精氨酸,負(fù)反饋控制,N-乙酰谷氨酸激酶,Arg-,天冬氨酸,天冬氨酰胺磷酸,天冬氨酸半縮醛,高絲氨酸,蘇氨酸,賴氨酸,天冬氨酸激酶,協(xié)同反 饋抑制,谷氨酸產(chǎn)生菌因環(huán)境條件變化而引起的發(fā)酵轉(zhuǎn)換,乳酸和琥珀酸,酮戊二酸,（通氣不足）,（適中）,（通風(fēng)過(guò)量，轉(zhuǎn)速過(guò)快）,NH4+,酮戊二酸,谷氨酸,谷氨酰胺,（適量）,（缺乏）,（過(guò)量）,pH值,谷氨酰胺，N-乙酰谷酰胺,谷氨酸,（pH值55.8，NH4+過(guò)多）,（中性或微堿性）,磷酸,纈 氨 酸,谷氨酸,（高濃度磷酸鹽）,（磷酸鹽適中）,生物素,乳酸或琥珀酸,谷氨酸,（過(guò)量）,（限量）,早期生產(chǎn)谷氨酸的方法有兩種，一是提取法：甜菜廠付

19、產(chǎn)物糖蜜中含有焦谷氨酸，用強(qiáng)堿處理可得到谷氨酸；二是蛋白質(zhì)水解法：將面筋加酸水解，再分離提純。 1957年發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸在日本協(xié)和發(fā)酵公司投產(chǎn)。 通過(guò)代謝調(diào)控發(fā)酵谷氨酸生產(chǎn)菌能夠在體外積累菌體最大生長(zhǎng)需要量300多倍的谷氨酸,三、谷氨酸發(fā)酵,（一）合成谷氨酸的生化途徑,谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP途徑）和己糖磷酸支路（HMP途徑）生成丙酮酸，再氧化成乙酰輔酶A（乙酰COA），然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，生成酮戊二酸。酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下，生成谷氨酸。,Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循環(huán) 乙

20、醛酸循環(huán)途徑，DCA循環(huán) CO2固定反應(yīng) -KGA的還原氨基化,（二）谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征內(nèi)在因素,1 生物素缺陷型 谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型,谷氨酸發(fā)酵時(shí), 控制生物素亞適量(貧乏量) ,引起菌種代謝失調(diào), 使谷氨酸得到大量積累。 2 具有CO2 固定反應(yīng)的酶系 菌種能利用CO2 產(chǎn)生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量積累。 3.-KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失 這是菌體生成并積累-KGA的關(guān)鍵，-KGA是菌體進(jìn)行TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，很快在-KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶A，在正常的微生物體內(nèi)他的濃度很低，也就是說(shuō)，由-KGA進(jìn)行還原氨基化生成GA的可能性很少。只有當(dāng)

21、體內(nèi)-KGA脫氫酶活性很低時(shí)，TCA循環(huán)才能夠停止，-KGA才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。,4.GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失 （1）NADPH是-KGA還原氨基化生成GA必須物質(zhì)，該還原氨基化所需要的NADPH是與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián) 的。 （2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定的積累，NADPH抑制-KGA的脫羧氧化。 5. 乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶 該酶是一種別構(gòu)酶，通過(guò)該酶酶活性的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，糖的代謝才能沿著 - 酮戊二酸的方向進(jìn)行, 從而有利于谷氨酸的積累。 6. 強(qiáng)烈的L-谷氨酸脫氫酶活性 -

22、KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP L-谷氨酸脫氫酶的酶活性強(qiáng)， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。,L-谷氨酸脫氫酶催化-酮戊二酸易生成谷氨酸是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)的： 偶聯(lián)反應(yīng) -KGA NADPH -KGA GA NADP 異檸檬酸,L-谷氨酸脫氫酶,異檸檬酸脫羧氧化, 氨基酸合成的方式 1.氨基轉(zhuǎn)移作用：轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)-酮戊二酸和其它氨基酸經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨酶的作用下使-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成谷氨酸。 2.谷氨酸合成酶催化反應(yīng)： 3. 還原氨基化作用：NH4+供氫體輔酶的存在下-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化下生成谷氨酸。,（三）GA 生物合成的理論得率,1.存在乙醛酸循環(huán)，體系

23、不存在CO2固定反應(yīng) 3/2 C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + 4 CO2 產(chǎn)率：147 /（180*3/2） = 54.4%,2. 封閉乙醛酸循環(huán)， 存在CO2固定反應(yīng) C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + CO2 產(chǎn)率：147 / 180 = 81.7%,CO2固定反應(yīng),(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GDP = 草酰乙酸 + GTP (2)蘋果酸酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH = 蘋果酸 + NAD 需要Mn2+做輔因子，所以，在GA發(fā)酵過(guò)程中需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)充Mn2+,（四）、生物素對(duì)GA發(fā)酵的影響,GA 產(chǎn)生菌

24、大都是生物素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，即：VH- 生物素對(duì)發(fā)酵的影響是全面的，在發(fā)酵過(guò)程中要嚴(yán)格控制其濃度。,1. 生物素對(duì)糖代謝的影響,（1） VH對(duì)于糖酵解有促進(jìn)作用;對(duì)丙酮酸的有氧氧化乙酰輔酶A的生成也有促進(jìn)作用， 對(duì)兩者的促進(jìn)作用不一樣，對(duì)前者大一些。這樣培養(yǎng)基中如果有較豐富的VH，就會(huì)打破糖酵解與丙酮酸氧化之間的平衡，導(dǎo)致丙酮酸的積累，丙酮酸積累則可能導(dǎo)致乳酸的形成，乳酸生成，則使得碳源利用率降低，而且?guī)?lái)的是發(fā)酵液的pH值下降。,當(dāng)VH缺乏時(shí)： A：丙酮酸的有氧氧化就會(huì)減弱(由于VH對(duì)TCA循環(huán)的促進(jìn)作用)，則：乙酰輔酶A的生成量就會(huì)少，產(chǎn)醋酸濃度降低，降低對(duì)異檸檬酸裂解酶的誘導(dǎo)作用； B：V

25、H對(duì)TCA循環(huán)促進(jìn)作用的降低，使中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，產(chǎn)生積累，阻遏和抑制異檸檬酸裂解酶作用加強(qiáng)； 兩者綜合的作用：異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環(huán)得到封閉。,（2）對(duì)乙醛酸循的調(diào)控。可以通過(guò)控制VH的濃度，以實(shí)現(xiàn)對(duì)于乙醛酸循環(huán)的封閉。,當(dāng)VH豐富時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性加強(qiáng)，則DCA 循環(huán)正常進(jìn)行，DCA循環(huán)的進(jìn)行，一方面提供了大量的“中間性產(chǎn)物”，另一方面，菌體的能荷水平得到提高。前者是菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，后者則是菌體增殖的能量的保證。結(jié)果是利于菌體的增殖和生長(zhǎng)；則GA的生物合成就會(huì)受到影響，甚至停止，這在生產(chǎn)上，就是通常我們說(shuō)的“只長(zhǎng)菌，不產(chǎn)酸”的現(xiàn)象。 以上分析說(shuō)明，GA發(fā)

26、酵過(guò)程中，前期，菌體的增殖期，一定量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。,2.生物素影響細(xì)胞膜的通透性,用能積累谷氨酸菌株做如下實(shí)驗(yàn): 生物素充足時(shí),細(xì)胞內(nèi)含大量谷氨酸,但培養(yǎng)液里幾乎不含谷氨酸 用溶菌酶消化細(xì)胞壁得到的原生質(zhì)體仍不分泌谷氨酸 當(dāng)把原生質(zhì)體放入低滲溶液里,將其漲破,谷氨酸才排出 生物素亞適量時(shí),培養(yǎng)液里含大量谷氨酸,細(xì)胞里含量少 結(jié)論:谷氨酸的分泌是由細(xì)胞膜控制；生物素影響細(xì)胞膜的通透性進(jìn)而影響谷氨酸積累,生物素是脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶,參與了脂肪酸的合成,進(jìn)而影響脂肪酸的合成.當(dāng)磷脂合成量少到正

27、常的1/2左右時(shí),細(xì)胞變形,Glu向膜外泄漏.,2. VH對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響,菌體進(jìn)入產(chǎn)物合成期時(shí)，有GA的產(chǎn)生，如果能夠大量的把產(chǎn)物及時(shí)的排泄到細(xì)胞膜外，可以解除GA對(duì)L-谷氨酸脫氫酶活性的抑制作用，從而使由GlucoseGA的高效率轉(zhuǎn)化。 谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是VH-，而VH又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，通過(guò)控制VH的濃度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)。 限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素亞適量(5-10g/L).在發(fā)酵初期(0-8小時(shí)),細(xì)胞可以正常生長(zhǎng),當(dāng)生物素耗盡后,在菌的再次倍增時(shí),開(kāi)始出現(xiàn)異常形態(tài)細(xì)胞,即完成了細(xì)胞從生長(zhǎng)型到積累型（細(xì)胞膜缺陷）轉(zhuǎn)換.,谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中,合適

28、的發(fā)酵條件如生長(zhǎng)素、發(fā)酵溫度、pH值、通風(fēng)和發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫都是影響谷氨酸積累的主要因素。 在實(shí)際生產(chǎn)中,只有針對(duì)存在的問(wèn)題,嚴(yán)格控制工藝條件,才能達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的目的。,（五）GA發(fā)酵的外在因素,1.供氧濃度/通風(fēng),過(guò)量： NADPH的再氧化能力會(huì)加強(qiáng)，使-KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA 的生成。 供氧不足： 則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化，積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。,2. NH4+濃度,（1）影響到發(fā)酵液的pH值 （2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)： NH4+過(guò)量，菌體增殖階段會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)酸階段Glu

29、會(huì)受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為Gln NH4+不足，不利于-KGA的還原氨基化， -酮戊二酸積累，引起反饋調(diào)節(jié),NH4+的供給方式： （1）流加液氨 （2）流加0.8%尿素,3.磷酸鹽,過(guò)量： （1）促進(jìn)EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等 （2）產(chǎn)生并積累Val，,4. 發(fā)酵液的碳氮比 碳源 在一定范圍內(nèi), 谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加；但糖含量過(guò)高, 滲透壓過(guò)大, 對(duì)菌體生長(zhǎng)不利, 谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率低。發(fā)酵液中還原糖的含量一般應(yīng)控制在10 %13 % , 氮源 氮源是合成菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸和谷氨酸的氨基來(lái)源，大約85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于

30、合成菌體。 谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多得多，一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100：0.22.0，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100：1521。 在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中, 菌體生長(zhǎng)期碳氮比應(yīng)大一些(氮低）,在產(chǎn)酸期,碳氮比應(yīng)小些(氮高）。,5. 生物素 對(duì)糖代謝的影響 對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響,6. 發(fā)酵溫度 谷氨酸發(fā)酵前期應(yīng)采取菌體生長(zhǎng)最適溫度,即3032 。溫度過(guò)低, 菌體生長(zhǎng)繁殖慢;若溫度過(guò)高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為DO值增長(zhǎng)慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長(zhǎng),產(chǎn)酸少。 發(fā)酵中、后期菌體生長(zhǎng)基本停止, 為積累大量谷氨酸, 應(yīng)適當(dāng)提高發(fā)酵溫度（產(chǎn)谷氨酸的最適溫度35-37 )。但溫度過(guò)高,酶易失

31、活,谷氨酸生成受阻。,7. pH值 1） pH值對(duì)谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的影響 當(dāng)高于或低于最適生長(zhǎng)pH值范圍:(1) 菌體內(nèi)的酶受到抑制, 菌體新陳代謝受阻, 生長(zhǎng)停滯; (2) 菌體細(xì)胞膜所帶電荷發(fā)生改變, 從而改變細(xì)胞膜的滲透性, 影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和代謝產(chǎn)物的排出; (3) 影響培養(yǎng)基組分和中間代謝產(chǎn)物的離解, 影響菌體對(duì)這些物質(zhì)的利用。 2） pH值對(duì)谷氨酸積累的影響 谷氨酸脫氫酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最適pH為7.07.2 ,當(dāng)發(fā)酵液的pH值偏酸時(shí)(pH 5.0-5.8) ,谷氨酸脫氫酶受到抑制。 在發(fā)酵后期由于耗用大量NH4+ ,pH值下降, 此時(shí)就要進(jìn)行pH值調(diào)節(jié),以保證發(fā)酵的正常進(jìn)行。前期pH（7.58.0），中后期pH7.07.6。通過(guò)采用流加尿素，氨水等辦法調(diào)節(jié)pH，補(bǔ)充氮源,8. 泡沫 谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵, 因通風(fēng)和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的, 但泡沫過(guò)多會(huì)帶來(lái)一系列問(wèn)題: (1) 泡沫形成泡蓋時(shí), 代謝產(chǎn)生的氣體不能及時(shí)排出,妨礙菌體呼吸作用,影響菌體的正常代謝; (2) 泡沫過(guò)多, 發(fā)酵液會(huì)外溢,造成浪費(fèi)和污染; (3) 泡沫過(guò)多,易沖上罐頂,造成染菌。,小結(jié)：谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征,1. -酮戊二酸氧化能力微弱: -酮戊二酸脫氫酶喪失或活