《蛋白酶活力測(cè)定》PPT課件.ppt

1、蛋白酶活力測(cè)定,一、概述 二、測(cè)定原理 三、試劑 四、操作手續(xù) 五、計(jì)算 六、注意事項(xiàng),一、概述,1什么是酶？ 2影響酶催化反應(yīng)的因素 3什么是酶的活力? 4測(cè)定意義 5. 測(cè)定方法,生物催化劑 特殊催化功能的蛋白質(zhì),酶的特性:,（1）作用有專一性、選擇性 （2）催化速度快 （3）反應(yīng)條件溫和 （4）化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),一種酶只作用一種底物： 淀粉酶：只能催化淀粉水解 糊精、低聚糖； 蛋白酶：只能催化蛋白質(zhì)水解 氨基酸、肽；,在激烈振蕩、加熱、紫外線、X-射線的照射，重金屬鹽作用下，它的二、三結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。而變性，失去催化能力這種現(xiàn)象叫做酶的失活,底物濃度 pH 溫度 時(shí)間,V Vmax 底物

2、濃度C C0 飽和濃度,底物濃度,OD pH pH最適,溶液pH的影響,酶的分類,酸性蛋白酶 3350 pH最適=24； 7401 pH最適=3.0 中性蛋白酶 1398 pH最適=77.5； 166 pH最適=78 堿性蛋白酶 2709 pH最適=911； 209 pH最適=9.511,OD T（） T最適,溫度的影響,3350：T最適 ：45-47 40以下穩(wěn)定 1398：T最適 ：30-37（pH：6.0-6.5 ） T最適 ：40-50（pH：7.0-7.5 ） 2709：T最適 ：45-55 40以下穩(wěn)定。,Q（反應(yīng)物的消耗量或生成物的生成量) t0 t,作用時(shí)間的影響,o,A,dQ

3、 dt,K,dQ dt,v,結(jié) 論,酶催化反應(yīng) 在反應(yīng)初速度時(shí)間內(nèi) 最適溫度 最適pH 飽合底物濃度 在最大活力處比較,在一定溫度、pH條件下，1g酶粉或1ml酶液，每分鐘催化水解酪蛋白（或血紅蛋白）所產(chǎn)生的酪氨酸的微克數(shù)，稱為酶的活力。 表示為：單位/g或單位/ml。通常人們愛講多少個(gè)單位。如一般出廠酶活力為5萬單位，即：50000g/g =0.05g酪氨酸/1g酶粉。,蛋白酶的活力定義：,測(cè)定意義,生皮蛋白質(zhì),膠原蛋白（80%-85%）,非膠原蛋白,彈性蛋白 網(wǎng)硬蛋白 間質(zhì)蛋白,酶的活力會(huì)下降 酶的催化能力強(qiáng),測(cè)定方法,乙醇滴定法、甲醛滴定法等 Folin-酚法，紫外分光光度法，殘氮量測(cè)定

4、法等等。 Gross法、明膠粘度下降法、凝乳作用法 酸性蛋白酶活性，還可以根據(jù)胰蛋白酶原激活作用的大小來表示。,福林試劑，在堿性情況下極不穩(wěn)定?？杀环宇惢衔镞€原，而呈藍(lán)色反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)或水解產(chǎn)物中含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)也呈這個(gè)反應(yīng)，因此可以利用這個(gè)原理來測(cè)定蛋白酶活性的強(qiáng)弱。,二、測(cè)定原理,1酶催化反應(yīng),酪蛋白,酶催化,條件,酪氨酸,白色至黃色粉沫，無臭無味，溶于稀堿、濃酸，在弱酸中沉淀，幾乎不溶于水，有吸濕性，干燥時(shí)穩(wěn)定，潮濕時(shí)迅速變質(zhì)。,條件： 底物濃度 溫度 pH 時(shí)間 選擇： C0 T最適 pH最適 t0 措施： C C0 恒溫水浴 緩沖溶液 t= t0 例子： 53

5、7 0.5%酪蛋白 40 3.0 10min 例子： 1398 0.5%酪蛋白 40 7.5 10min 例子： 2709 0.5%酪蛋白 40 10 10min,2.顯色反應(yīng),福林試劑 + 酪氨酸 OH- HO CH2CHCOOH 還原性 NH2,鉬藍(lán)+鎢藍(lán),藍(lán)色物質(zhì),顯色劑,Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 福林試劑 HCL Li2SO4 Br2,顯色劑,亮金黃色,3朗伯-比爾定律及其應(yīng)用,E 吸光度 A 消光值 OD 光密度 E = KL = lg（I0/I） = K C 透光率 T = I I0,入射光強(qiáng)度I0,透過光強(qiáng)度I,有色真溶液,C,L,朗伯-比爾定律的應(yīng)用,X

6、 RX OD,被測(cè)組分的濃度與光密度OD成直線關(guān)系,X OD,OD=KCRX,OD= KCX,選擇max,注 意:,max =680nm,OD值的范圍,OD=0.20.6 OD=0.43,4制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,酪氨酸濃度C OD C1 OD1 C2 OD2 C3 OD3 Cn ODn,福林酚法測(cè)定蛋白酶活力 方法要點(diǎn),配制系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下（T、pH、t）與福林試劑顯色后，測(cè)定光密度OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精稱酶制劑，配成適當(dāng)濃度的溶液。以酪素為底物，在一定溫度、pH下與上述酶液作用一定時(shí)間，用三氯醋酸終止反應(yīng),并使未水解的酪素沉淀，過濾，移取濾液，加入碳酸鈉調(diào)節(jié)pH為堿性，再加入

7、福林試劑，顯色后測(cè)定光密度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算出被測(cè)酶制劑的活力。,三、試劑,10 CL3CCOOH 水溶液 0.55mol/L碳酸鈉溶液 緩沖溶液 福林試劑 顯色劑 一種雜多酸,磷鉬酸 H3P（Mo3O10）4 磷鎢酸 H3P（W3O10）4,福林試劑的配制,Na2WO42H2O 100g Na2MoO42H2o 25g Li2 SO4 50g H2O 100ml 10hr + 85H3PO4 50ml H2O 50ml 濃HCL 100ml 混勻 + 溴水 15 冷卻 黃色 過濾,回流,金黃色溶液,(1)檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液pH=3.0,A液：0.1mol/L檸檬酸 21.01g C6

8、H8O7H2O 1000ml CH2COOH HOC COOH CH2COOH B液：0.1mol/L檸檬酸納 29.4g Na3C6H5O72H2O 1000ml 用時(shí)：AB=18.61.4混合,檸檬酸檸檬酸鈉溶液的pH計(jì)算,弱酸弱酸鹽緩沖體系 pH = pka1+lg（C酸/C鹽） = 3.13+ lg（C酸/C鹽） 檸檬酸: pKa1 = 3.13 pKa2 = 4.76 pKa3 = 6.40,（2）0.02mol/L的磷酸鹽緩沖溶液,A液：0.2mol/L NaH2PO4溶液 31.2g NaH2PO42H2O 1000ml,B液：0.2mol/L Na2HPO4溶液 71.7g N

9、a2HPO412H2O 1000ml, pH=7.2的磷酸鹽緩沖溶液,A液 28ml B液 72ml,H2O,1000ml, pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液,A液16ml B液84ml,H2O,1000ml,磷酸鹽緩沖溶液pH計(jì)算,pH = pKa + lg（C酸/C鹽） H2PO4- = 7.21+lg HPO4= Ka2 = 6.1710-8,（3）硼砂氫氧化納緩沖溶液 pH=10,A液：0.055mol/L Na2B4O7 8 H2O 19g Na2B4O7 8 H2O 1000ml B液：0.2 mol/L NaOH 8g NaOH 1000ml A液50ml B液43ml,H2O,20

10、0ml,硼砂氫氧化納緩沖溶液的pH計(jì)算,弱酸弱酸鹽緩沖體系 Na2B4O7 + 7H2O NaOH + 4H3BO3 H3BO3 + H2O B(OH)4- + H+ 一元弱酸Ka=5.610-10 pH=pka1-lg（C酸/C鹽） =9.24- lg（C酸/C鹽）,四、操作手續(xù),（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 1配制100g/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 2配制系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 3. 與福林試劑反應(yīng)顯色，測(cè)OD值 4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 （二）測(cè)定蛋白酶活力實(shí)測(cè) 1緩沖溶液的配制 2底物配制 3待測(cè)酶液配制 4測(cè)定,（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,1配制100g/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,0.1000g酪氨酸 0.1mol/

11、LHCL 100ml容量瓶 1mg/ml=1000g/ml 再移取10ml 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶 0.1mg/ml=100g/ml,思考題,為什么酪氨酸要干燥至恒重？ 為什么酪氨酸要稱準(zhǔn)至0.1000g？ 為什么酪氨酸用鹽酸溶解？ 為什么要先配成1000ug/ml，再配成100ug/ml？,2配制系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,3系列濃度的酪氨酸顯色并測(cè)OD值,酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml 搖勻 10分鐘 藍(lán)色 冷卻 1cm比色皿 680nm波長,5ml0.55mol/L Na2CO3,40水浴,0號(hào)調(diào)零，測(cè)OD值,福林試劑1ml,說明,（1）各試劑均用刻度移液管移取 （2）顯色后需冷卻

12、到室溫 （3）每一點(diǎn)測(cè)兩份，OD0.01 共3618支干試管,4數(shù)據(jù)處理,（1）畫圖求直線斜率的倒數(shù)K （2）計(jì)算K （3）直接查取 （4）計(jì)算機(jī)處理，回歸曲線：C=K.OD,（1）畫圖求直線斜率的倒數(shù)K,C K = OD （g/ml OD）,OD,C,C（g/ml）,C,OD,（2）計(jì)算K,Kn = K1+K2+K3+K4+K5 K=,Cn,ODn,5,（3）直接查取,（4）計(jì)算機(jī)處理，回歸曲線：C=KOD,（二）測(cè)定蛋白酶活力實(shí)測(cè),1緩沖溶液的配制 2底物配制 3待測(cè)酶液配制 4測(cè)定,1緩沖溶液的配制,酸性蛋白酶。如：537 pH最適=3.0 檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液 pH=3.0 中性蛋白

13、酶。如：1398 pH最適 =77.5； 0.02mol/L的磷酸緩沖溶液 pH=7.5 堿性蛋白酶。如：2709 pH最適 = 9 11； 硼砂氫氧化納緩沖溶液 pH=10,2底物配制,中性、堿性蛋白酶 0.5或2酪素 飽合濃度,0.5酪素溶液的配制,0.5g酪素 潤漲 透明 調(diào)pH =pH最適 冷卻 100ml,0.5mol/L的NaOH,0.1mol/L的HCL,沸水浴,pH=pH最適的緩沖溶液,3配制待測(cè)酶液,0.5g酶粉 研磨 5 研磨 5 攪拌 沉降 轉(zhuǎn)移清液 研磨 反復(fù)3-4次 200ml 8層干沙布 過濾 吸取 10ml濾液 100ml容量瓶,緩沖溶液,配制酶液的關(guān)鍵,稀釋倍數(shù)與稱量質(zhì)量的原則 光密度OD=0.4（或0.2-0.6） 研磨時(shí)間,酪蛋白 酪氨酸 酪氨酸 + 福林試劑 藍(lán)色溶液,3測(cè)定,酶催化,條件,操作手續(xù)（一）,操作手續(xù) (二),測(cè)定OD 值,測(cè)定溫度：室溫 比色皿厚=1cm max=680nm “0”號(hào)調(diào)零，測(cè)1、2平行管 OD0.01