如何成功申請國家自然科學(xué)基金.ppt

1、如何成功申請國家自然科學(xué)基金,第一部分基金委面上項目評審基本程序及重要環(huán)節(jié),初 審： 由各學(xué)科處組織實施。 申請者不具備申請資格或違反有關(guān)規(guī)定； 手續(xù)不完備或申請書不符合要求; 內(nèi)容不符合資助范圍或超出資助能力; 申請者以往資助項目執(zhí)行不利。,查 重：由基金委信息中心組織實施。 高職申請與承擔(dān)（含參加）面上、重點、重大 累計不超過3項； 在職研究生不作為限項申請的條件但只可申請 面上項目； 申請者同期只能申請一項，每個項目申請者限 為一人; 高職申請者當(dāng)年申請及承擔(dān)的在研面上項目累 計不超過兩項; 不具有高職的申請者申請及負責(zé)的在研面上項 目不超過一項; 青年基金只能獲得一項資助。,同行評議（

2、一審）： 由基金委各學(xué)科處組織實施?；境绦颍?每份申請書選擇同行評議專家（5位）； 函請同行評議：對項目進行定性定量評價； 收回評議卡； 對定量部分進行計算機判讀、打分、排序； 據(jù)學(xué)科資助項目數(shù)130確定第二輪評審項目。,專家評審組或?qū)I(yè)委員會評審（二審）。 主要對一審?fù)扑]項目進行評議，篩除 30。 再次對二審會確定資助項目進行審查： 進一步查重； 以往承擔(dān)項目是否按期完成； 是否有違反基金委有關(guān)申請規(guī)定。 基金委員會委務(wù)會審議。 下發(fā)批準(zhǔn)、未批準(zhǔn)通知。,第二部分 如何撰寫國家自然科學(xué)基金申請書,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義等,如：“用方法（手段）進行研究，探

3、索/證明問題，對闡明機制 揭示規(guī)律有重要意義，為奠定基礎(chǔ)提供思路 ”,采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞差異表達基因文庫并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。通過基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞，觀察細胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。,二、立論依據(jù) 對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述項目科學(xué)意義 對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題論述其應(yīng)用前景,在研究領(lǐng)域（疾病防治）層面,從研究方向展開,圍繞

4、本項目擬解決的問題 進行歸納分析,提出設(shè)想,從研究領(lǐng)域（疾病防治）切入,研究意義,立論依據(jù),1、項目的研究意義 存在問題：對科學(xué)意義闡述不足或夸大。 撰寫方法：從疾病入手，簡述其特點、危害，目前主要的治療方法及其存在的問題。 簡要分析該病發(fā)病機理和主要研究熱點，引出目前存在的主要問題，也就是本項目要解決的問題，以此為切入點提出假設(shè)，闡述如果實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，對該病甚至相關(guān)疾病的預(yù)防、治療具有的理論意義和臨床價值。,老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增加，其發(fā)病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化，白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。目前，它已是人類第一位的致盲疾病。迄今為止,治療白內(nèi)障唯一有效的

5、方法是通過手術(shù)摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。雖然手術(shù)后患者可以恢復(fù)良好的視力，但是不可避免的術(shù)后并發(fā)癥以及手術(shù)設(shè)備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障所花費的資金已成為世界各國包括富裕的發(fā)達國家嚴(yán)重的醫(yī)療負擔(dān)。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的發(fā)病時間延緩10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會減少45%1。所以，一些學(xué)者認(rèn)為通過預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展的途徑征服白內(nèi)障已成為一項全球性的社會和社會經(jīng)濟問題2。,但是目前我們對老年性白內(nèi)障發(fā)病機理的認(rèn)識還不十分清楚。多年以來許多學(xué)者的研究結(jié)果證實晶狀體上皮細胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對其中進一步的基因調(diào)控知之甚少。如果從參與老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細

6、胞變化的相關(guān)基因入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點，以晶狀體上皮細胞為研究對象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對其功能進行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。,2、國內(nèi)外現(xiàn)狀分析（綜述） 存在問題： 文獻復(fù)習(xí)不夠，對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏真正了解， 提出的問題別人已解決-低水平重復(fù)。 對研究方法不熟悉，簡單移植或夸大其作用， 缺乏實際應(yīng)用的可行性-無法實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。 -已有方法與掌握方法的人的結(jié)合； -方法理

7、論上可行與現(xiàn)實可行性的結(jié)合。 對國內(nèi)外現(xiàn)狀只是簡單羅列，缺乏歸納分析， 缺乏邏輯性和針對性-總結(jié)與表達不夠。,(,撰寫方法：要緊緊圍繞本次申請項目的主題。 1、從疾病切入，簡要論述國內(nèi)外研究成果， 并引出當(dāng)前的熱點研究方向。 2、從研究方向展開，較詳細地分析國內(nèi)外在 本方向的研究進展，引出闡明疾病發(fā)病機理或發(fā)明 新的治療方法的關(guān)鍵問題所在。 3、圍繞關(guān)鍵問題，詳細論述國內(nèi)外以往的研 究結(jié)果、當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢。綜合分析 后提出目前尚未解決的問題。,4、對擬采用的技術(shù)方法進行介紹和分析。 成熟的方法要簡要介紹，重點闡明可以應(yīng)用于本研究的依據(jù)。 新方法要詳細介紹其原理，并闡明可以應(yīng)用于本研

8、究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。 要特別注意的問題：必須對項目中所運用的技術(shù)方法的原理、流程及在實際應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚，絕不能是一種簡單的移植。 例如：單鏈抗體+功能基團，理論上可以實現(xiàn)融合，但存在“活性、表達載體選擇、純化”等問題。 5、提出本項目的研究設(shè)想。,防治白內(nèi)障必須針對其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來，國內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機理。就致病的環(huán)境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長因子、細胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。就研究的部位分，晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體

9、上皮細胞在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。,因為晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對穩(wěn)定的細胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對稱的結(jié)構(gòu)，對維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細胞還是晶狀體中受外來刺激影響較早的部位，已有研究證實老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細胞還發(fā)生退行性變、細胞膜通透性增加、細胞內(nèi)酶活性改變、細胞數(shù)量減少、凋亡細胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異3-5 。,體外實驗也證實多種因素(H2O2、UV-B、晶 狀體蛋白的自身抗體)誘發(fā)的白內(nèi)障模型中晶狀體 上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié)6-8。因此， 從

10、晶狀體上皮細胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因， 有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機理的主要環(huán)節(jié)。而晶 狀體上皮細胞變化的基因調(diào)控機制是問題的關(guān)鍵所 在，也是有待我們深入研究的問題。,白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果，包括基因的和非基因的隨機變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機性的組織特異性多種基因表達的改變。目前，國內(nèi)外對白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面：,一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細胞的研究。UV-B輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細胞是主要的靶細胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細胞的凋亡增加，

11、其中有c-fos基因的表達增加；還有組蛋白H4、H3 的低表達和蛋白酶C、-肌動蛋白、-肌動蛋白基因的高表達9-12。Carper等13利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技術(shù)研究H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細胞的基因差異性表達結(jié)果顯示NADH脫氫酶4亞基、細胞色素b、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達減少以及細胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、-三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達的增加。,二是利用轉(zhuǎn)基因動物的研究。波形纖維蛋白基因

12、（vimentin）、雜交的型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢。晶狀體改變的共同特點是晶狀體纖維細胞分化受抑制14,15。Gong等16報告晶狀體的細胞膜蛋白連接蛋白3（3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶狀體形成的早期及纖維細胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。雖然體外實驗和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進一步的報告。,三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Lee17利用RT-PCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與

13、核性白內(nèi)障上皮細胞中纖維連接蛋白、I型膠原纖維、-平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF-型受體、結(jié)締組織生長因子的基因表達有差異。Kantorow等18利用RT-PCR-DD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障有三個高表達基因和12個低表達的基因。但就DD-PCR技術(shù)來講，在實驗中難以解決假陰性、假陽性以及克隆全長cDNA的問題。,上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。 尋找白內(nèi)障時晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機理。,尋找差異表達基因的經(jīng)

14、典方法是消減雜交技術(shù)（subtractive hybridization, SH），它是，但是實驗操作復(fù)雜。 經(jīng)過改進后的抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）簡化了實驗操作，但仍然問題很多。 我校生化教研室建立了改良消減雜交技術(shù)19，20，其特點是：簡便易行，能夠獲得目的細胞特異表達的全長基因，對低豐度基因也能有效分離。,該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其中5個為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)

15、障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因，并克隆到全長cDNA，為進一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。,基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測差異表達基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效?；蛐酒窃?996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的DNA探針集中到1厘米見方的基片上，利用堿基互補原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測定的未知DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而對檢測基因進行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。,由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯 片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達 的所有基因建立cDNA文庫，再利用基因

16、芯片技術(shù) 制備成基因芯片，以此檢測多個樣本中白內(nèi)障晶狀 體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基 因，從中進一步篩選出白內(nèi)障特異的基因，它們中 可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩 種技術(shù)的有機結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地 得到白內(nèi)障相關(guān)基因。,綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。本項目從晶狀體上皮細胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對體外培養(yǎng)細胞和在體晶狀體上皮細胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們在晶狀體上皮細胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學(xué)機制，為

17、防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。,注意事項,注意邏輯性和層次感，并隨時點題。 文字表達要精雕細琢，避免假大空。 參考文獻必須提供作者全名、出處。 參考文獻必須引用02年甚至03年的文獻。 要注意參考國內(nèi)相關(guān)專業(yè)知名專家的論著。 文獻回顧不能回避國內(nèi)外最新研究進展。,三、研究方案,1、研究目標(biāo) 存在問題： 目標(biāo)過大 撰寫要求： 有限目標(biāo)，與研究內(nèi)容相呼應(yīng),如：探索問題，明確關(guān)系，揭示規(guī)律， 闡明原理（機制），建立方法等,研究目標(biāo)： 篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機理，為防治白內(nèi)障提供線索。,2、研究內(nèi)容： 存在問題：內(nèi)容

18、過多，一個研究周期難以完成；內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)。 撰寫要求：內(nèi)容要適當(dāng)，確保研究周期內(nèi)完成；與目標(biāo)相輔相成，為研究目標(biāo)服務(wù)。篇幅要適度，注意與技術(shù)路線區(qū)別。 確定研究目標(biāo)、內(nèi)容的依據(jù)：回答一個科學(xué)問題； 根據(jù)研究周期、資助強度來確定。,研究內(nèi)容： （1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞差異表達的基因片段，建立cDNA文庫。制備差異表達基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個標(biāo)本的老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。,（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)：對白內(nèi)障 相關(guān)基因cDNA進行特異擴增、PCR產(chǎn)物的克隆、

19、鑒定，測定基因序列，分析基因的結(jié)構(gòu)，獲得全長 基因。 （3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細胞 變化中的作用：利用反轉(zhuǎn)錄病毒，對培養(yǎng)的人晶狀 體上皮細胞和在體小鼠晶狀體進行基因轉(zhuǎn)染，觀察 白內(nèi)障相關(guān)基因?qū)铙w上皮細胞的影響以及在白 內(nèi)障形成中的作用。,觀察指標(biāo)如下：存活細胞數(shù)；光鏡、透射 電鏡下細胞形態(tài)的變化；細胞凋亡檢測：用原位 末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo)PCR方法，從形態(tài)和DNA 水平分析細胞凋亡；細胞增殖的檢測：用免疫組 織化學(xué)的方法檢測核蛋白Ki-67；細胞骨架蛋白 （Vimentin、Actin）的檢測：用Northern雜交 法檢測vimentin 、actin mRNA的表達，用SD

20、S- PAGE及Western blot方法檢測波形纖維蛋白、肌 動蛋白（均為尿素溶性蛋白）；晶狀體蛋白的檢 測：用SDS-PAGE方法觀察水溶性蛋白、 晶狀體蛋白的變化。,3、擬解決的關(guān)鍵問題： 存在問題：未能抓住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)。 撰寫要求：找出關(guān)鍵問題，寫出解決辦法。 什么是關(guān)鍵問題 ？ -研究過程中對達預(yù)期目標(biāo)有重要影響的 某些研究內(nèi)容或因素。 -為達預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或 研究手段。,擬解決的關(guān)鍵問題： （1）建立差異表達的cDNA文庫： 建立差異cDNA文庫是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。 為使差異cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案： 選擇各種類型老年性白內(nèi)障

21、晶狀體的前囊膜、取足夠 大量的標(biāo)本（擬取50例標(biāo)本）作為建庫的mRNA的來源。 利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表 達的完整cDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項技術(shù)中已積累了較豐富的實驗經(jīng)驗。,（2）制備基因芯片： 制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相 關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關(guān)鍵是在 1平 方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不 使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時做到： 嚴(yán)格按操作程序進行；在標(biāo)本的處理及RNA提 取時避免污染，否則即會造成嚴(yán)重的損失。只要嚴(yán) 格按操作程序進行操作就可以避免發(fā)生差錯。,（3）在體基因轉(zhuǎn)染： 在體基因轉(zhuǎn)染是

22、進行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。 在體的晶狀體上皮細胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤道 前區(qū)的少量細胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原 性質(zhì)的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大 量分裂后細胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對以 上問題我們擬采取下列方法解決：選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病 毒載體（ lentiviral vector ），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細胞的局限性，對分裂后細胞也能有效的 轉(zhuǎn)染。這對在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染有很大的優(yōu)越性。采用 直徑1-2m玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前 囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜 下的上

23、皮細胞。,4、研究方法 存在問題： 過于簡單：在實驗方案中只有方法名稱而無具體步驟。 過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實驗方法。 撰寫要求：以研究項目的需求為前提，盡量采用目前 最先進的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體 現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。,本課題主要利用改良消減雜交技術(shù)和基因 芯片技術(shù)篩選老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與 正常晶狀體上皮細胞有差異表達的基因，分析 其結(jié)構(gòu)，預(yù)測其功能，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)探討 其在晶狀體上皮細胞變化、白內(nèi)障形成中的作 用，從晶狀體上皮細胞的角度揭示老年性白內(nèi) 障發(fā)生的分子生物學(xué)機制。,5、技術(shù)路線 存在問題： 不清楚，不詳細。 撰寫要求： 清晰、詳細、注意邏輯性。 撰

24、寫方法： 以時間順序為主線設(shè)計技術(shù)路線 以研究內(nèi)容為主線設(shè)計技術(shù)路線 分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。 詳細地寫清楚每個具體步驟。,（1）人晶狀體上皮細胞的獲得：老年性白內(nèi)障 晶狀體上皮細胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊 膜（晶狀體上皮細胞緊貼于前囊膜），直徑約5mm。 正常晶狀體上皮細胞取自角膜移植供體眼的晶狀體， 在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8mm。按文獻提供 的方法去除晶狀體纖維細胞，仔細清洗以去除血細 胞污染。 （2）建立差異cDNA文庫：從50例白內(nèi)障手術(shù) 患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為實驗組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞 作為對照組，利用改良的消減雜交技術(shù)19，

25、20， 獲得差異表達的cDNA，并建立文庫。主要的實驗流程如下：,正常晶狀體上皮細胞 白內(nèi)障晶狀體上皮細胞 Promega PolyATtract System 1000 mRNA分離 mRNA分離 oligo-dT18反轉(zhuǎn)錄 ntech Cap-finder方法反轉(zhuǎn)錄 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 隨機引物PCR 雜交 Sephacryl S-400柱,除鹽及小片段 鏈親和素-生物素磁性分離 除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細胞cDNA “長距離”PCR 目的cDNA的特異擴增 克隆、鑒定、轉(zhuǎn)化 建立差異基因文庫,（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： 基因

26、芯片的制備： 白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選：取10例正常晶狀體前囊膜上的晶狀體上皮細胞為對照組。分次取老年性白內(nèi)障前囊膜200例，分成20組，每組10例，取上皮細胞。提取上皮細胞中總RNA，分離純化mRNA。采用RT-PCR技術(shù)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并用熒光標(biāo)記，根據(jù)文獻報道的方法（Schena M. et al Science 1995,170:467）進行雜交。雜交后用氬離子束激發(fā)熒光標(biāo)志，經(jīng)閱讀器識別、計算機分析，獲得雜交的定量結(jié)果。統(tǒng)計20次每個cDNA片段的雜交陽性率和強度，確定篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出可能與白內(nèi)障關(guān)系密切的基因片段。,(4) 白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析： 序列測定：. . 序列的計算機分

27、析： . . a.基因片段的同源性分析： . . b.氨基酸序列的同源性分析： . . c.基因序列的編碼區(qū)分析： . . d.局部組成復(fù)雜性分析： . . e.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的分析： . . 獲得全長基因： . .,(5) 基因轉(zhuǎn)染： A、培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞的轉(zhuǎn)染： 存活細胞數(shù)：. 細胞凋亡的檢測：. 細胞增殖的檢測：. 細胞骨架蛋白的檢測：. 晶狀體蛋白的檢測：. B、在體晶狀體的轉(zhuǎn)染： 形態(tài)學(xué)觀察：. 取晶體前囊膜，分離其下晶狀體纖維，作A中-項檢測。通過以上研究，分析白內(nèi)障相關(guān)基因?qū)w上皮細胞的作用及與白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)系。,6、可行性分析 理論分析 研究手段、方法分析 預(yù)實驗結(jié)果分析

28、所用特殊實驗材料（試劑）的分析 對所具備的實驗條件進行分析 對項目組成員搭配及其運用技術(shù)方法的能力分析,(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫： 老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞是處在不同狀態(tài)下的細胞，細胞基因表達的改變 是細胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基 因是探索細胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口。利用的 消減雜交技術(shù)是篩選差異表達基因的有效方法。改良 的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用 此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表 達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其 中 5個為新基因，這一研究成果進一步證實了該方法 的可操作性，而且我們在運用此方法過

29、程中也積累了 較豐富的經(jīng)驗，因此，本研究利用這一方法從兩種狀 態(tài)的晶狀體上皮細胞中篩選差異表達的基因并建立 cDNA文庫是可行的。,(2)關(guān)于制備基因芯片和篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： (3)關(guān)于白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析： (4)關(guān)于在體基因轉(zhuǎn)染的可行性分析： 綜上所述，我們的研究方案從理論到實踐都是 可行的，實驗中所涉及到的材料和試劑均為商品， 本校生物化學(xué)實驗室為全軍開放實驗室、基因研究 所、中心實驗室及本實驗室具備完成該項研究的實 驗條件，預(yù)計可以實現(xiàn)本項目的預(yù)期目標(biāo)。,7、創(chuàng)新性 對創(chuàng)新的理解：創(chuàng)新性與先進性是有根本區(qū)別的。 原始創(chuàng)新： 填補空白或修改傳統(tǒng)的理論； 新技術(shù)、新方法的發(fā)明創(chuàng)造。

30、跟蹤創(chuàng)新： 在前人工作基礎(chǔ)上補充、完善現(xiàn)有理論； 對原有技術(shù)、方法進行修改后產(chǎn)生112的 效果。,（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新： 首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀 體上皮細胞差異表達基因文庫，并制備相應(yīng)的基因 芯片，利用此基因芯片篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因。 這使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得白內(nèi)障 相關(guān)基因。通過分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的 功能，揭示老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分 子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。 （2）基因功能研究上的創(chuàng)新：.,8、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果 年度研究計劃： 按年度列出：研究內(nèi)容及其階段目標(biāo)；擬組織 的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流

31、計劃等。 預(yù)期研究結(jié)果： 理論成果：建立/豐富/補充/填補 . 技術(shù)方法：建立/完善 . 專 利：可望獲得 論 文：國際、國內(nèi) 人才培養(yǎng)：青年科技骨干、博碩研究生,研究計劃及預(yù)測進展： 2001.01-2001.12 ： （1）采用改良的消減雜交技術(shù)篩選白內(nèi)障 晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞差異 表達的基因，建立cDNA文庫。 （2）制備白內(nèi)障晶狀體上皮細胞差異表達 基因芯片。 2002.01-2002.12 ：. 2003.01-2003.12 : .,預(yù)期的研究成果 通過本項目的系統(tǒng)研究，有望闡明老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學(xué)機制，從晶狀體上皮細胞的角度揭示白內(nèi)障的發(fā)病機理

32、，為白內(nèi)障防治提供理論依據(jù)。 研究成果以論文和科技進步獎提供。預(yù)計在國際、國內(nèi)期刊上發(fā)表論文8-10篇。,四、研究基礎(chǔ) 1、工作基礎(chǔ) 存在問題： 內(nèi)容過簡； 與申請項目無關(guān)。 撰寫要求： 要介紹與申請項目直接相關(guān)的研究結(jié)果； 提供有關(guān)的研究論文、成果及專利等材料； 以往應(yīng)用與申請項目有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)歷。 工作積累也要包括項目組成員的所有信息。,（1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ): 本研究所用的基因篩選技術(shù)主要是改良的消減雜 交技術(shù)，此技術(shù)是我們研究組成員主要參與建立的， 并利用此技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異 表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因， 其中5個為新基因，有關(guān)此技術(shù)的研究論文有：. （2）有關(guān)基因轉(zhuǎn)染方面的研究工作基礎(chǔ)：. （3）有關(guān)老