生化反應(yīng)曲線資料.ppt

1、生化反應(yīng)曲線,生化分析基本原理,生化反應(yīng)曲線,內(nèi)容概況,羅氏生化分析系統(tǒng)產(chǎn)品線,Cobas 6000 (c501) 600T/H,Modular D 2400T/H,Modular P 800T/H,Cobas c311 300T/H,Cobas c111 180T/H,Cobas 8000 2000T/H,cobas 8000 模塊化組合分析系統(tǒng) 智能、高效、強勁,物質(zhì)對光吸收的基本定律 Lambert- Beer定律,LambertBeer定律表達為: 當一束平行的單色光通過含有均勻吸光物質(zhì)的溶液時,溶液的吸光度(A)與溶液的濃度(C)和光透過液層厚度(L)的乘積成正比。物質(zhì)對光吸收的吸光

2、系數(shù)（e）為常數(shù)。 其數(shù)學(xué)表達式：A = e*C*L,I,入射光,透射光,I0,=,=,-光吸收的基本定律,=,light detector,根據(jù)Lambert- Beer定律來計算待測物濃度 如若吸光系數(shù) ( )未知，我們就需要采用定標曲線 來計算待測物的濃度。,Concx = Absx x Concs Abss Concx = 待測樣本濃度 Concs = 標準品濃度 Absx = 樣本吸光度 Abss = 標準品吸光度,此值為定值,Lambert-Beer 定律 適合于任何均勻非散射的介質(zhì),生化比色分析,特定蛋白透射比濁分析,Lambert-Beer 定律,分光光度法定量分析的依據(jù),Ro

3、che Hitachi Photometer,當相應(yīng)的比色杯每一次通過光路系統(tǒng)時，光路系統(tǒng)會測量并記錄下相應(yīng)的吸光度 光路系統(tǒng)可以測量后分光后12個波長的相應(yīng)吸光度。 12 有效波長: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多數(shù)檢測項目都使用雙波長檢測方法。（可去除干擾物對檢測結(jié)果的影響）,Reaction sequence,儀器讀數(shù)的原理,不同儀器每個循環(huán)周期的時間間隔 Modular P 18秒 Cobas c702 16秒 Cobas C501 8秒 Modular D 12秒 C311 12秒,反應(yīng)轉(zhuǎn)盤

4、不停的周期旋轉(zhuǎn),當相應(yīng)的比色杯通過光路系統(tǒng)時，光路系統(tǒng)會測量并記錄下相應(yīng)的吸光度,在不同的時間點加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑,Reaction sequence,Instrument cycle,Endpoint and rate (kinetic) assays,自動生化分析常用的方法有:,終點法（End Point Assays）：一般在整個反應(yīng)完成后再來檢測吸光度 速率法（Rate assays） ：一般在反應(yīng)的過程中監(jiān)測吸光度的變化情況,終點分析法,時間,吸光度,A 1,t,S+R1,基于 被測物質(zhì)在反應(yīng)過程中到達反應(yīng)終點或平衡點，根據(jù)該點吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點法。,終點法的計算：

5、 從時間-吸光度曲線來看，到達反應(yīng)終點時，吸光度將不再變化。在達到終點時任取一點進行測定，此時底物和產(chǎn)物的量都不再變化。,吸光度,A 1,S+R1,吸光度,兩點終點法（2-point end） 一點終點法 （1-point end） 一點終點單試劑（1-point endpoint assay one reagent） 一點終點雙試劑（1-point endpoint assay two reagents） 三點終點法（3-point end）,終點分析法（Endpoint assays）,兩點終點法,在被測物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時，選擇第一個吸光度，在反應(yīng)到達終點或平衡時選擇第二個吸光度，

6、此兩點吸光度之差用于計算結(jié)果。,去除了樣本的本底 采用兩個測量點 針對兩個或多個試劑的項目 第一個讀數(shù)點一般選在添加最后一個試劑之前 第二個讀數(shù)點一般選在加入最后一個試劑之后且已經(jīng)達到了反應(yīng)終點,兩點終點法的特點,Endpoint assays,兩點終點法的反應(yīng)曲線Cobas c702,Endpoint assays,Sample+R1,Mp1 abs before addition of R3,Mp2 abs at reaction end,兩點讀數(shù)的時間點: 第19點測量包含了樣本和試劑1的本底 sample + reagent 1 第 38點在加入所有試劑后，反應(yīng)達到終點 sample

7、+ reagent 1+ reagent 2,兩點終點法的應(yīng)用參數(shù) Cobas c702,2Point Endpoint assay application settings,RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM,兩點終點法分析項目舉例,Endpoint assays,一點終點法,A單試劑一點終點法 例如:CHOL/TG.,在反應(yīng)到達終點，即在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值，用于計算結(jié)果。,B雙試劑一點終點法 Mg(雙試劑),單試劑一點終點法的特點（1-point endpoint assay one reagent） 不包含樣本的本底 僅進

8、行一個點的測量 檢測項目舉例：甘油三酯（TG）,Endpoint assays,單試劑一點終點法的反應(yīng)曲線1-point endpoint assay one reagents,Endpoint assays,不包含樣本的本底 僅進行一點測量 應(yīng)用項目舉例： Magnesium 不采用兩點終點法主要是樣本和R1體積相加仍180uL(最小反應(yīng)體積，無法測量）,雙試劑一點終點法的特點（1-point endpoint assay two reagents）,1st entry: 方法類型 2nd entry:總分析時間 3rd - 6th entry:測量點,一點終點法應(yīng)用參數(shù)（1 Point E

9、ndpoint assay）,Utility - Application - Analyze,TRIGL CHO,一點終點法分析項目舉例,Endpoint assays,例如,多項同測組合試劑盒,CHO與TG同一測定,即雙終點法,在一個通道內(nèi)一次進行兩項反應(yīng)相關(guān)的終點法測定.,三點終點法,上升 increasing 或 下降decreasing,終點法反應(yīng)的方向（Reaction Direction）,速率法,吸光度,t,t2,t1,t3,t4,A1,A2,A3,S+R,時間,A 1,利用線性反應(yīng)期，計算出單位時間的吸光度變化A/min，來計算酶的活性。,單位時間的吸光度變化量是一致的,在酶促

10、反應(yīng)過程中,在反應(yīng)速度恒定期(線性反應(yīng)期)來連續(xù)觀察和記錄一定 反應(yīng)時間內(nèi)底物或代謝產(chǎn)物變化速度的化學(xué)方法.,速率A法 （Rate A） 兩點速率法（2-point Rate）,速率法（Endpoint assays）,速率A法,A 單試劑速率法 例如:ACPAFU,B 雙試劑速率法 例如:ALTASTCK,在較長的反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi),每隔一定時間讀取一次吸光度值,至少讀取4點,得到3個A,求出單位時間的反應(yīng)速率 A/min . 通過最小二乘法（least squares method）,Rate A assay Modular P,Reag. at R3 timing,Rate assays,G

11、OT/ASTGGT GPT/ ALT Lipase ALPGLDH AmylaseLDH CHE CKMB,速率A 法-分析項目舉例,Rate assays,2點速率法,2點速率法,尿素氮,指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，此兩點既非反應(yīng)初始吸光度亦 非終點吸光度，這兩點的單位時間吸光度差值用于結(jié)果計算。,2-point Rate assay,Rate assays,Enzyme,采用一種或多種試劑 檢測兩個測量點檢測固定的間隔時間內(nèi)兩點的吸光度變化。 換算成 Abs/min參與計算 在加入最后最后一個試劑之后進行吸光度檢測。,兩點速率法的特點2-point Rate assay,Rate

12、 assays,2-point Rate assay Modular P,Rate assays,Ammonia Acid phosphataseNon-prostatic phosphatase Urinary/CSF protein Bicarbonate Urea,Rate assays,2點速率 法-分析項目舉例,Reaction Direction,上升decreasing 或 下降increasing,生化反應(yīng)曲線,Thank you for your attention,Roche Diagnostics (Shanghai) Limited Shanghai 200031 China,This presentation is our intellectual property. Without our written consent, it shall neither be copied in any manner, nor used for manufacturing, nor communicated to third parties.,COBAS and LIFE NEEDS ANSWERS ar