酶工程_05-酶分子修飾-2012.ppt

1、酶 工 程Enzyme Engineering,第 五 課 酶 分 子 修 飾 Modification of Enzyme Molecules,酶 分 子 修 飾,什么是酶分子修飾 酶分子修飾（enzyme molecular modification） 通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過(guò)程 酶分子工程（enzyme molecular engineering） 指按照酶的各種特性的需要，依據(jù)結(jié)構(gòu)性能間的關(guān)系，在分子水平上實(shí)現(xiàn)酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和操作 分子生物學(xué)水平：用基因工程方法對(duì) DNA 或 RNA 進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更合理的酶蛋白 一級(jí)結(jié)構(gòu)水平：對(duì)

2、天然的酶分子進(jìn)行改造，包括酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等,?,酶 分 子 修 飾,對(duì)酶進(jìn)行分子修飾的原因和依據(jù) 在非生理?xiàng)l件下，酶的某些性質(zhì)不滿足工程應(yīng)用 生理最適溫度、pH 值 體外最適溫度、pH 值 酶分子對(duì)熱、酸、堿、有機(jī)溶劑的耐受性較差 酶在非生理?xiàng)l件下活力下降，抗原性顯著 理論依據(jù)和方法 酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與酶催化特性的關(guān)系：構(gòu)效關(guān)系 理性設(shè)計(jì)（rational design）：找出關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在掌握酶的構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上，有目的地對(duì)其進(jìn)行改造 半理性設(shè)計(jì)（semi-rational design）：以基因的隨機(jī)重組為手段，參考酶的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)的改造,酶 分 子 修

3、 飾,酶分子修飾的意義：我們究竟要做什么？ 應(yīng)用角度 酶工程 提高酶的催化效率，改變底物專一性 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，降低 / 消除酶的抗原性 研究角度 酶學(xué) 研究酶分子中一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)酶空間構(gòu)象的影響，進(jìn)一步探索酶的結(jié)構(gòu)與催化特性之間的關(guān)系 探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目 探索酶分子的拓?fù)鋵W(xué)及寡聚酶的亞基結(jié)合狀態(tài) 探測(cè)酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)，以及結(jié)構(gòu)變化與運(yùn)動(dòng) 探索酶的作用機(jī)理和催化反應(yīng)歷程,催化特性,環(huán)境適應(yīng)性,酶 分 子 修 飾,酶分子修飾的條件 修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞維持酶活性功能的必需基團(tuán) pH 值與離子強(qiáng)度 決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài) 修飾反應(yīng)的溫

4、度與時(shí)間 嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng) 反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 控制二者的比例，防止酶的過(guò)度修飾而導(dǎo)致的活性完全喪失,酶 分 子 修 飾,酶 分 子 修 飾,化學(xué)修飾的方法學(xué),揭示了蛋白質(zhì)必需基團(tuán)的化學(xué)修飾和活性喪失的定量關(guān)系 鄒氏作圖法 袁勤生,現(xiàn)代酶學(xué)p139,酶 分 子 修 飾,化學(xué)修飾的方法學(xué),酶 分 子 修 飾,酶分子修飾的種類 金屬離子置換修飾（重點(diǎn)） 大分子結(jié)合修飾（重點(diǎn)） 側(cè)鏈基團(tuán)修飾（重點(diǎn)） 親和修飾 肽鏈有限水解修飾（重點(diǎn)） 核苷酸鏈有限水解修飾 氨基酸置換修飾 核苷酸置換修飾 酶分子的物理修飾 酶的定向進(jìn)化修飾,酶 分 子 修 飾,金屬離子

5、置換修飾 Metal ion substitute modification 把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法 通過(guò)修飾了解各種金屬離子在酶催化過(guò)程中的作用，闡明催化機(jī)制 適用對(duì)象：金屬酶（metalloenzyme） 一種結(jié)合金屬的酶，以一個(gè)或幾個(gè)金屬離子作為 輔因子 金屬離子或是直接參與催化作用，或是對(duì)保持酶的活性和構(gòu)象起穩(wěn)定作用 金屬酶純化時(shí)仍保留著定量 的功能金屬離子,酶 分 子 修 飾,金屬離子置換修飾 常見(jiàn)的金屬酶及其離子種類 -淀粉酶 Ca2+、Mg2+、Zn2+ 谷氨酸脫氫酶 Zn2+ 過(guò)氧化氫酶 Fe2+ ?；被崦?Zn2+ 超氧化

6、物歧化酶 Cu2+、Zn2+ 細(xì)胞色素 P450 單加氧酶 Fe2+ 固氮酶 Fe(II)、Mo(IV) 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 Se(IV) 主要的金屬離子 Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等,Cyt P450,酶 分 子 修 飾,金屬離子置換修飾 金屬離子置換修飾的方法 酶的提純 除去原有金屬離子 加入金屬螯合劑，如 EDTA 等，讓酶分子中的金屬離子與 EDTA形成螯合物 透析、超濾或?qū)游龀ヲ衔?加入置換的離子 加入含另一種金屬離子的溶液，酶蛋白與其結(jié)合 用透析或?qū)游龅确椒ǔノ唇Y(jié)合的離子,酶 分 子 修 飾,金屬離子置換修飾 金屬離子置換修飾的作用 闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的

7、影響 一般在活性中心的金屬離子能與底物或輔酶 / 輔基可逆結(jié)合，從而起到催化作用 提高酶的催化效率 將 Zn 型-淀粉酶置換成 Ca 型，活力可提高 20%30% 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 Fe-SOD 置換成 Mn-SOD 后穩(wěn)定性增強(qiáng)，對(duì) NaN3 敏感性降低 改變酶的動(dòng)力學(xué)特性 ?；被崴饷富钚圆课坏?Zn 被 Co 置換后，酶的底物專一性（Km 值）和最適 pH 都顯著改變,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 Macromolecules combine modification 采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶催化特性的方法 常用的大

8、分子 糖、糖的衍生物 聚乙二醇（PEG） 含 C=C 雙鍵單體聚合得到的聚合物 多肽鏈，甚至蛋白質(zhì),酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 大分子結(jié)合修飾的方法 選擇修飾劑 選擇溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、無(wú)毒的大分子 聚乙二醇（PEG）、寡聚糖、多糖及其衍生物等 修飾劑的活化 將修飾劑分子中的基團(tuán)（OH）轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性的基團(tuán) 修飾反應(yīng) 將活化過(guò)的修飾劑與純化的酶液按照一定比例混合反應(yīng)，控制溫度、pH 等條件 分離 層析分離，除去多余的修飾劑,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） PEG 既可溶于水，又可溶于多種有機(jī)溶劑 微毒

9、或無(wú)毒 免疫原性低 生物相容性好，已通過(guò) FDA 認(rèn)證 分子量范圍很寬，從幾百到數(shù)十萬(wàn)，選擇余地大 末端有兩個(gè)能被活化的 OH 基團(tuán) 為了獲得單功能的PEG，將其中一個(gè)羥基轉(zhuǎn)化為烷氧基，即單甲氧基聚乙二醇（MPEG）,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 MPEG 三氯均三嗪活化法（重點(diǎn)掌握）,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 MPEG 疊氮法：將OH轉(zhuǎn)化為N3 基團(tuán),酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 MPEG 琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 MPEG 重氮法：將OH轉(zhuǎn)化為N=N 基團(tuán),酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾

10、修飾劑 右旋糖酐（dextran） 右旋糖酐是由葡萄糖通過(guò) -1,6-糖苷鍵 形成的高分子多糖 水溶性較好 生物相容性好 糖鏈上的 2,3-雙羥基 經(jīng)活化后可與酶分子中的氨基結(jié)合,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 右旋糖酐 溴化氰（CNBr）法：糖酐活化,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 右旋糖酐 溴化氰（CNBr）法：與酶偶聯(lián),酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 右旋糖酐 高碘酸（HIO4）氧化法,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 右旋糖酐 高碘酸（HIO4）氧化法：增加連接臂,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 肝素（heparin） 由 D-

11、葡萄糖醛酸（或 L-艾杜糖醛酸）和 N-乙酰氨基葡萄糖形成重復(fù)二糖單位組成的多糖 在體內(nèi)外都有抗凝血作用 臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)、血液透析等,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 肝素 碳二亞胺法（COOH 反應(yīng)）,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 修飾劑 肝素 三氯均三嗪法,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 大分子修飾的作用 提高酶的催化效率 根本原因：改變了酶的空間構(gòu)象，有可能促使酶活性中心與底物更容易結(jié)合 酶的催化功能是由其空間結(jié)構(gòu)決定的 例1：1 分子核糖核酸酶與 6.5 分子右旋糖酐共價(jià)結(jié)合，活力提高到原有的 2.25 倍

12、 例2：1 分子胰凝乳蛋白酶與 11 分子右旋糖酐共價(jià)結(jié)合，酶的催化效率提高到原酶的 5.1 倍,位阻效應(yīng),酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 大分子修飾的作用 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 水溶性大分子與酶結(jié)合，在酶分子外層形成保護(hù)層，可以保護(hù)酶的空間構(gòu)象 不溶性大分子與酶結(jié)合，形成固定化 酶，也提高酶的穩(wěn)定性 穩(wěn)定性的表征 半衰期 酶的半衰期：酶活力降低到原來(lái)活力一半時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間,酶 分 子 修 飾,大分子結(jié)合修飾 大分子修飾的作用 降低或消除抗原性 酶非經(jīng)口（如注射）進(jìn)入人體后，會(huì)成為一種抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體；當(dāng)這種酶再次注射進(jìn)體內(nèi)時(shí)，抗體就會(huì)與作為抗原的酶特異地結(jié)合，使酶失去催化功能 經(jīng)過(guò)大分子

13、修飾，酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使酶蛋白與抗體之間不再發(fā)生特異性識(shí)別，從而降低了酶蛋白與體內(nèi)抗體的結(jié)合幾率 例如：L-天冬酰胺酶 EC 3.5.1.1 經(jīng) PEG 修飾后抗原性顯著降低，已經(jīng)在 1994 年被 FDA 批準(zhǔn)用于治療急性淋巴性白血病,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 Side residues modification 采用一定的（化學(xué)）方法，使酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶催化特性的修飾方法 用于研究各種基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響 熒光試劑修飾側(cè)鏈，了解酶在水溶液中的構(gòu)象 各基團(tuán)對(duì)酶結(jié)構(gòu)和活性的影響，研究必需基團(tuán)的組成 對(duì)非催化基團(tuán)修飾可改變酶的

14、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力 利用側(cè)鏈修飾測(cè)定某種基團(tuán)在酶分子中的數(shù)量 改變酶的結(jié)構(gòu)和催化性能,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 兩類酶的修飾 蛋白類酶 側(cè)鏈基團(tuán)可組成各種次級(jí)鍵對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定起重要作用，而當(dāng)這些功能基團(tuán)發(fā)生改變，引起次級(jí)鍵改變，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而引起酶特性和功能的改變 親核性側(cè)鏈基團(tuán)：OH、COOH、NH2、SH、咪唑環(huán) 親核性取代的氨基酸殘基: Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His 等 親電性側(cè)鏈基團(tuán)：芳香環(huán)、吲哚環(huán) 親電性取代的氨基酸殘基: Tyr、Trp 核酸類酶 磷酸基，核糖糖環(huán)上的OH、堿基雜環(huán)及其NH2、OH等,酶 分

15、子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 幾種重要的修飾反應(yīng) ?；?OH（Ser、Thr、Tyr）、SH（Cys）、NH2（Lys） 烷基化 多種基團(tuán)均可發(fā)生，包括芳環(huán)和雜環(huán) 氧化和還原 酚基、SH、雜環(huán)等 芳香環(huán)取代 涉及 Phe、Tyr、Trp 等幾種芳香族氨基酸 其他反應(yīng)，如 CNBr 裂解反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 各類側(cè)鏈基團(tuán)的修飾 氨基修飾（Lys） 羧基修飾（Asp、Glu） 巰基修飾（Cys） 胍基修飾（Arg） 羥基修飾（Ser、Thr、Tyr） 咪唑基修飾（His） 吲哚基修飾（Trp） 甲硫基修飾（Met） 分子內(nèi)交聯(lián),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 1. 氨基（NH2）

16、修飾的主要特點(diǎn) 氨基在酶蛋白中主要是 Lys 的 -NH2 和肽鏈末端氨基 非質(zhì)子化的 -NH2 親核反應(yīng)活性很高，易被選擇性修飾 一般情況下 -NH2 的 pKa = 10，其解離程度取決于微環(huán)境 氨基的修飾反應(yīng)主要有酯化、N-烷基化等,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 氨基 ?；磻?yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 氨基 TNBS 反應(yīng)和 Sanger 反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 氨基 N-烷基化,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 2. 羧基（COOH）修飾的主要特點(diǎn) 羧基在酶蛋白中主要是 Asp 和 Glu 的 側(cè)鏈 COOH，以及肽鏈的末端羧

17、基 在水溶液中，COOH 通常解離成負(fù)離子，親核性降低，對(duì)其修飾的方法有限，主要反應(yīng)為成酯、成酰胺反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 羧基 碳二亞胺反應(yīng)（羧基修飾的標(biāo)準(zhǔn)方法）,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 羧基 酯化反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 3. 巰基（SH）修飾的主要特點(diǎn) 巰基在酶蛋白中的來(lái)源是 Cys 的 -SH 巰基的親核性強(qiáng)，往往是酶分子中反應(yīng)活性最高的基團(tuán) 巰基容易被氧化成 SS，在維持蛋白亞基之間的相互作用和酶催化過(guò)程中起重要作用 巰基用烷基化試劑修飾后一般能得到穩(wěn)定的修飾產(chǎn)物,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 巰基 二硫鍵置換反

18、應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 巰基 與含汞有機(jī)物的反應(yīng)（SH 對(duì) Hg 的親和力很強(qiáng)）,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 巰基 S-烷基化反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 4. 胍基（N=C(NH2)2）修飾的主要特點(diǎn) 胍基存在于酶蛋白的 Arg 殘基側(cè)鏈上 在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起重要作用 胍基堿性強(qiáng)，難以和大多數(shù)試劑反應(yīng)，一般采用具有兩個(gè)鄰位羰基的化合物，在中性或弱堿性條件下反應(yīng)，一般是可逆反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 胍基（與鄰二酮的反應(yīng)）,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 5. 酚基和羥基（OH）修飾的主要特點(diǎn) 酶蛋白

19、中含羥基的氨基酸殘基有：Ser、Thr、Tyr 羥基的專一性修飾較困難，通常修飾劑能同時(shí)修飾羥基、氨基和巰基 Tyr 的酚羥基相比于 Ser 和 Thr 的羥基要活潑一些，更容易發(fā)生修飾；酚基具有芳香性，能發(fā)生親電取代反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 酚基和酚羥基 酚基親電取代反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) （酚）羥基 O-?；磻?yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 6. 咪唑基修飾的主要特點(diǎn) 咪唑基存在于酶蛋白的 His 殘基側(cè)鏈上 His 是多種酶的活性中心，是電荷中繼網(wǎng)中的重要成員 對(duì) His 咪唑基的修飾，一般是通過(guò) N-烷基化或 C-親核取代來(lái)進(jìn)行

20、 對(duì)咪唑進(jìn)行修飾后，酶活性一般會(huì)受到顯著影響,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 咪唑基 N-取代反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 咪唑基 雜環(huán)上的親電取代反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 7. 吲哚基修飾的主要特點(diǎn) 吲哚基存在于酶蛋白的 Trp 殘基側(cè)鏈上 Trp 殘基疏水性較強(qiáng)，一般位于酶分子的內(nèi)部，反應(yīng)活性比氨基和巰基差，因此對(duì)其修飾較困難很多能與吲哚基反應(yīng)的試劑，一般優(yōu)先與巰基或氨基反應(yīng) 有時(shí)候 Tyr 會(huì)對(duì)吲哚基的修飾產(chǎn)生干擾,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 吲哚基 與 Koshland 試劑的反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 8. 甲

21、硫基修飾的主要特點(diǎn) 酶蛋白中 Met 殘基中的硫以硫醚的形式存在 硫醚中的硫原子雖然具有親核性，但反應(yīng)活性較差，在溫和的條件下一般不發(fā)生反應(yīng) 硫醚的主要反應(yīng)主要是氧化反應(yīng)，產(chǎn)物為砜和亞砜；另外，采用某些試劑也可以進(jìn)行 S-烷基化反應(yīng),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 修飾反應(yīng) 甲硫基,酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 9. 分子內(nèi)交聯(lián)（掌握概念） 采用雙功能基團(tuán)化合物（雙功能試劑），在酶分子中對(duì)空間距離較近 的兩個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)之間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián),酶 分 子 修 飾,側(cè)鏈基團(tuán)修飾 分子內(nèi)交聯(lián)試劑 同型、異型 可裂解、不可裂解,酶 分 子 修 飾,親和修飾 Affinity modificat

22、ion，酶的專一性修飾 試劑作用于特定部位的某一基團(tuán)，而不與這一部位之外的同類基團(tuán)反應(yīng) 用于酶化學(xué)修飾的試劑，即使對(duì)某一基團(tuán)反應(yīng)是專一的，也仍然有多個(gè)同類殘基與之反應(yīng)，因此對(duì)某個(gè)特定殘基的選擇性修飾比較困難，為了解決此問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了親和標(biāo)記試劑 這類修飾劑也稱為位點(diǎn)專一性抑制劑，一般具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，對(duì)酶活性部位具有高度的親和性，可專一性標(biāo)記于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也稱專一性不可逆抑制劑,酶 分 子 修 飾,親和修飾,酶 分 子 修 飾,親和修飾 親和標(biāo)記試劑的特點(diǎn) 在使酶不可逆失活以前，要與酶形成可逆復(fù)合物 親和試劑的修飾程度是有限的 競(jìng)爭(zhēng)性類似物的存在會(huì)降低修飾反應(yīng)速率 親

23、和試劑體積不能太大，否則造成較大的空間位阻 修飾產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定，應(yīng)便于表征和定量,酶 分 子 修 飾,親和修飾 KS 型（競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)記試劑） 根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，具有與底物結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合基團(tuán)，同時(shí)還具有能與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的活性基團(tuán) 特點(diǎn) 底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑及其他結(jié)構(gòu)類似物對(duì)修飾具有保護(hù)作用 修飾反應(yīng)是定量定點(diǎn)進(jìn)行的 Kcat 型（自殺性標(biāo)記試劑） 根據(jù)酶催化過(guò)程設(shè)計(jì)，專一性很高 具有酶的底物性質(zhì)，還有一個(gè)潛在的反應(yīng)基團(tuán)在酶催化下活化，與酶活性部位氨基酸側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)，不可逆地結(jié)合,酶 分 子 修 飾,肽鏈有限水解修飾 Peptide chain limit hydrolysis modi

24、fication 在肽鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生精細(xì)改變，從而改變酶催化特性的修飾方法 肽鏈?zhǔn)堑鞍最惷傅闹麈湥敲阜肿咏Y(jié)構(gòu)的基礎(chǔ) 活性中心的肽段是酶催化作用必不可少的 活性中心之外的肽段維持酶的空間構(gòu)象 肽鏈被水解后可能出現(xiàn)的情況 酶活性中心破壞，酶失去催化功能 探測(cè)酶活性中心位置 酶活性中心構(gòu)象完整，酶活力保持不變或損失不多，但抗原性發(fā)生變化 提高酶的藥用價(jià)值 活性中心形成，與底物結(jié)合能力提高并形成準(zhǔn)確的催化部位 酶催化功能增強(qiáng)或酶活力提高,酶 分 子 修 飾,肽鏈有限水解修飾 酶蛋白主鏈修飾 酶切 / 酶原激活法 胃蛋白酶原（pepsinogen）的自激活 意義：保護(hù)作用，避

25、免了過(guò)量的胃蛋白酶對(duì)胃壁自身進(jìn)行消化,酶 分 子 修 飾,肽鏈有限水解修飾 酶蛋白主鏈修飾 酶切 / 酶原激活法 胰蛋白酶原（trypsinogen）的水解激活,利用胰蛋白酶或腸激酶從 trypsinogen 的 N-端切除一段六肽序列：N-Val(Asp)4Lys,酶 分 子 修 飾,肽鏈有限水解修飾 酶蛋白主鏈修飾 酶切 / 酶原激活法 胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,酶 分 子 修 飾,肽鏈有限水解修飾 酶蛋白主鏈修飾 酶切 / 酶原激活法 Klenow 片段：基因工程的工具酶,E.coli DNA 聚合酶 I 經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的 C-末端

26、 605 個(gè)氨基酸殘基片段。 保留了 DNA 聚合酶 I 的 5 3 聚合酶和 3 5 外切酶活性，但缺少完整酶的 5 3 外切酶活性。,酶 分 子 修 飾,核苷酸鏈剪切修飾 Nucleotide chain cleavage modification 僅見(jiàn)于 R 酶的分子修飾，指在核苷酸鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使 R 酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變其催化特性的方法 L-19 IVS 的形成 四膜蟲(chóng)（Tetrahymena）26S rRNA 前體自我剪接形成成熟的 26S rRNA，同時(shí)生成414 nt 的線性間隔序列 LIVS LIVS 經(jīng)一系列剪接、環(huán)化、開(kāi)環(huán)過(guò)程最終得到多功能 R 酶 L-19

27、 IVS,酶 分 子 修 飾,氨基酸置換修飾 Amino-acid substitute modification 將酶分子肽鏈上的某一個(gè)氨基酸置換成另一個(gè)氨基酸，從而改變酶催化特性的修飾方法 肽鏈上某個(gè)氨基酸的改變會(huì)引起酶化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變 氨基酸置換修飾的作用 提高酶的催化效率（例：酪氨酸-RNA 合成酶 Thr51 Pro51，對(duì)ATP 親和力提高近 100 倍，催化效率提高 25 倍） 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（例：T4 溶菌酶 Ile3 Cys3，與 Cys97 形成二硫鍵，熱穩(wěn)定性提高） 改變酶的專一性（例：農(nóng)桿菌 -葡萄糖苷酶 Glu358 Ala358，失去水解活性，卻能催化糖苷合

28、成）,酶 分 子 修 飾,氨基酸置換修飾 置換修飾方法 化學(xué)修飾 對(duì)某些側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相近的氨基酸殘基進(jìn)行基團(tuán)修飾，從而變成另一種氨基酸殘基 難度較大，很難精確操作,酶 分 子 修 飾,氨基酸置換修飾 置換修飾方法 定點(diǎn)突變 在 DNA 序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變 蛋白質(zhì)工程常用的技術(shù)手段 1983年，美國(guó)生物學(xué)家 Ulmer 首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念 蛋白質(zhì)工程通過(guò)改造蛋白質(zhì)相對(duì)應(yīng)基因中的堿基排列次序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆到宿主細(xì)胞中，通過(guò)基因表達(dá)而獲得具有新特性的蛋白質(zhì)的技術(shù)過(guò)程 蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在技術(shù)方面有諸多同基因工程技術(shù)相似的地方，因此蛋白

29、質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程,酶 分 子 修 飾,氨基酸置換修飾 定點(diǎn)突變主要步驟 1) 新的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) 根據(jù)已知蛋白酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)及其特性，確定新蛋白質(zhì)或酶的氨基酸排列順序，乃至欲置換的核苷酸及其位置 2) 突變基因的核苷酸序列確定,酶 分 子 修 飾,氨基酸置換修飾 定點(diǎn)突變主要步驟 3) 突變基因的獲得 用 DNA 合成儀合成有數(shù)個(gè)核苷酸被置換了的寡核苷酸鏈，再以此寡核苷酸鏈為引物，通過(guò) PCR 擴(kuò)增獲得所需的大量突變基因，即寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變 4) 新酶的獲得 重組表達(dá) 將定位突變獲得的突變基因進(jìn)行體外重組，插入適當(dāng)?shù)幕蜉d體中，通過(guò)基因操作技術(shù)轉(zhuǎn)入特定的宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)

30、并表達(dá)所需的修飾酶,酶 分 子 修 飾,氨基酸置換修飾 實(shí)驗(yàn)操作大致步驟 1) 先測(cè)定酶的一級(jí)結(jié)構(gòu) 2) 用 NMR、X 射線衍射法等方法分析測(cè)定其三維結(jié)構(gòu) 3) 根據(jù)結(jié)構(gòu)信息選擇突變部位，即選定哪一個(gè)氨基酸殘基要被取代 4) 選擇 46 個(gè)氨基酸殘基的寡肽序列，其間含待取代的氨基酸殘基 5) 用化學(xué)法合成由 1218 個(gè)堿基組成并為所選寡肽的氨基酸序列編碼的核苷酸序列，作為定位誘變的引物 6) 構(gòu)建單股質(zhì)粒，含有為所需蛋白質(zhì)編碼的基因，作為定點(diǎn)突變的模板,酶 分 子 修 飾,氨基酸置換修飾 實(shí)驗(yàn)操作大致步驟 7) 將引物與單鏈模板 DNA 配對(duì)，用 PCR 法將引物延長(zhǎng)，形成互補(bǔ)鏈，得到共價(jià)

31、閉合的雙鏈DNA，也叫異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒 8) 將異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞（如 E.coli），轉(zhuǎn)化為兩個(gè)同質(zhì)雙鏈質(zhì)粒，一個(gè)含天然蛋白質(zhì)編碼的基因，另一個(gè)含編碼突變體的基因 9) 將這兩個(gè)基因分離并克隆，最后產(chǎn)物是細(xì)胞轉(zhuǎn)化突變型，能合成突變體蛋白質(zhì)，與母體蛋白質(zhì)僅有 1 個(gè)氨基酸的差別，這個(gè)氨基酸就是事先選定的突變部位,酶 分 子 修 飾,核苷酸置換修飾 Nucleotide substitute modification 將 R 酶分子核苷酸鏈上的某個(gè)（或數(shù)個(gè)）核苷酸置換成其他的核苷酸，一般采用定位突變技術(shù) 自我剪切酶的保守序列和剪切位點(diǎn)序列與酶的催化作用關(guān)系密切 對(duì)自我剪切酶的結(jié)構(gòu)與功能研究可了

32、解酶催化中心必需基團(tuán)，據(jù)此進(jìn)行分子改造，從催化分子內(nèi)反應(yīng)的 R 酶設(shè)計(jì)出催化分子間反應(yīng)的 R 酶,酶 分 子 修 飾,核苷酸置換修飾 核苷酸置換對(duì)催化特性的影響 例：L-19 IVS 活性中心堿基變化,酶 分 子 修 飾,核苷酸置換修飾 Nucleotide substitute modification 例：錘頭型核酶（hammer head ribozyme）,1989年，Koizumi 證明只要保留11個(gè)核苷酸保守序列即可催化自我剪切反應(yīng)。,酶 分 子 修 飾,核苷酸置換修飾 錘頭型核酶的置換修飾 除了 11 個(gè)保守核苷酸以外的其他核苷酸都可以置換修飾,酶 分 子 修 飾,核苷酸置換修飾

33、 發(fā)夾型核酶（hairpin ribozyme）的置換修飾 1989年，Hamp 提出煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）負(fù)鏈 RNA 自我剪切反應(yīng)是基于發(fā)夾結(jié)構(gòu)（一種回文結(jié)構(gòu)），只要形成此結(jié)構(gòu)就會(huì)在底物識(shí)別序列處自動(dòng)催化剪切反應(yīng),酶 分 子 修 飾,酶分子的物理修飾 Physical modification 通過(guò)各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法 研究極端條件下酶結(jié)構(gòu)和活性的變化 “極端微生物” 物理修飾的特點(diǎn) 不改變酶的組成單位及其基團(tuán) 酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變 酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)不變 副鍵發(fā)生某些改變和重排 酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,酶 分 子 修 飾,酶分子

34、的物理修飾 物理修飾的效果 改變底物特異性 例：羧肽酶 經(jīng)高壓處理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反應(yīng)（逆反應(yīng)） 改變酶催化的最適溫度 例：纖維素酶經(jīng)高壓處理，最適溫度下降，但在 3040 oC 條件下，活力提高了 10% 提高酶的穩(wěn)定性 例：用鹽酸胍破壞胰蛋白酶的空間構(gòu)象，伸展肽鏈，再透析除去鹽酸胍，在不同溫度下重新構(gòu)建 / 恢復(fù)酶的構(gòu)象，50 oC 下重新構(gòu)建的酶穩(wěn)定性比天然酶提高 5 倍,酶 分 子 修 飾,酶的定向進(jìn)化修飾 Enzyme directed evolution 模擬自然進(jìn)化（隨機(jī)突變和自然選擇）的過(guò)程，在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件

35、的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體 定向進(jìn)化的三個(gè)過(guò)程 隨機(jī)突變：產(chǎn)生基因多態(tài)性 構(gòu)建突變基因文庫(kù)：將突變基因與適當(dāng)?shù)妮d體重組 定向選擇：高通量篩選方法 隨機(jī)突變的方法 易錯(cuò) PCR（error-prone PCR） DNA 改組（DNA shuffling）,酶 分 子 修 飾,酶的定向進(jìn)化修飾 易錯(cuò) PCR（error-prone PCR） 通常 PCR 使用的 Taq DNA 聚合酶失去了 35 方向的校正活性，因此核苷酸錯(cuò)誤摻入的幾率約為 510-5 如果配合適當(dāng)?shù)臈l件，調(diào)整正常 PCR 體系中 dNTPs 的濃度，提高 Mg2+ 濃度，引入 Mn2+ ，可以高頻率

36、隨機(jī)引入錯(cuò)配的突變位點(diǎn)，構(gòu)建突變文庫(kù)，再篩選突變體 連續(xù)多次反復(fù)地隨機(jī)誘變，通過(guò)每一步的積累產(chǎn)生有益突變,酶 分 子 修 飾,酶的定向進(jìn)化修飾 DNA 改組（DNA shuffling） 從正突變的基因庫(kù)（可以通過(guò)易錯(cuò)PCR 構(gòu)建）中分離出 DNA 片段，用脫氧核糖核酸酶 DNaseI 隨機(jī)切割，得到的隨機(jī)片段經(jīng)過(guò)不加引物的多次 PCR 循環(huán)，隨機(jī)片段之間互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，直至獲得全長(zhǎng)的基因 將親本基因群中的優(yōu)勢(shì)突變盡可能地組合在一起，最終使酶分子的某一性質(zhì)得到進(jìn)一步進(jìn)化,酶 分 子 修 飾,酶的定向進(jìn)化修飾 突變文庫(kù)的定向篩選 根據(jù)進(jìn)化的目標(biāo)設(shè)定選擇環(huán)境條件 例：為提高酶的熱穩(wěn)定性，可

37、以在較高的溫度下培養(yǎng)重組細(xì)胞，并在每一次“突變篩選”的循環(huán)中逐步提高培養(yǎng)溫度 高通量篩選 96 孔板（384 孔板）篩選 標(biāo)記篩選（熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記） 噬菌體表面展示技術(shù) 酵母細(xì)胞表面展示技術(shù) ,酶 分 子 修 飾,酶的定向進(jìn)化修飾 例：對(duì)硝基芐酯酶的定向進(jìn)化修飾,酶 分 子 修 飾,酶的定向進(jìn)化修飾 例：酯酶的定向進(jìn)化修飾 將 10 g 用 PCR 擴(kuò)增過(guò)的親本 DNA 片段用 DNaseI 切割，在Pwo DNA 聚合酶催化下進(jìn)行第一次 PCR 擴(kuò)增，35 輪循環(huán)后補(bǔ)加 Pwo DNA 聚合酶，再進(jìn)行 35 輪循環(huán)，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二次 PCR 常規(guī)擴(kuò)增 將擴(kuò)增產(chǎn)物和 pNB106

38、R 質(zhì)粒用 BamHI 和 XbaI 酶切，體外連接后轉(zhuǎn)化到 E. coli. TG1 宿主細(xì)胞中，獲得重組子 在一定濃度 DMF 溶液中對(duì)底物 LCN-pNB 的催化活力進(jìn)行篩選，得到一株高活性進(jìn)化酶；在 DMF 水溶液中催化水解含 p-硝基芐酯結(jié)構(gòu)的化合物活力可提高 30 倍,酶 分 子 修 飾,修飾酶的特性總結(jié),修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)變化,最適pH值,熱穩(wěn)定性,體內(nèi)抗原性,半衰期,酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì),對(duì)組織的 分布能力變化,酶 分 子 修 飾,修飾酶的特性總結(jié) 熱穩(wěn)定性 修飾劑與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)，一般能增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性，可能的原因是多點(diǎn)交聯(lián)產(chǎn)生固定酶分子構(gòu)象的效應(yīng) PEG 修飾酶在熱穩(wěn)定性上沒(méi)有明顯提

39、高，可能由于 PEG 和酶是單點(diǎn)交聯(lián) 酶分子內(nèi)基團(tuán)間相互作用在受熱情況下發(fā)生了變化，向熱力學(xué)上熵增加的方向變化，即從緊密有序趨于隨機(jī)松散 通過(guò)修飾后，使酶天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開(kāi)，減小熱振動(dòng)，從而增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性,酶 分 子 修 飾,修飾酶的特性總結(jié) 最適 pH 值 一般情況下，修飾酶的最適 pH 范圍擴(kuò)大 豬肝尿酸酶的最適 pH 為10.5，在pH 7.4 的生理環(huán)境中酶活僅剩 510%，用白蛋白修飾后，最適 pH 范圍擴(kuò)大，在pH 7.4 時(shí)仍保留 60% 酶活 吲哚-3-鏈烷羥化酶修飾后，最適 pH 從 3.5 增加到 5.5，在 pH 7左右時(shí)，修飾酶活力比天然酶增加 3 倍

40、，在生理環(huán)境下抗腫瘤效果比天然酶大得多 可能的原因 修飾酶的微環(huán)境更穩(wěn)定 修飾酶被“固定”在一個(gè)更活潑的狀態(tài),酶 分 子 修 飾,修飾酶的特性總結(jié) 半衰期 酶經(jīng)修飾增強(qiáng)了抗蛋白水解、抗抑制劑和抗失活因子的能力及對(duì)熱穩(wěn)定性提高，半衰期一般都比天然酶延長(zhǎng) 體內(nèi)抗原性 有些修飾劑在消除酶抗原性上并無(wú)作用，如 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修飾酶；糖類物質(zhì)也不容易消除酶的抗原性 現(xiàn)在比較公認(rèn)的是 PEG 和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明顯，原因可能是修飾劑破壞（共價(jià)結(jié)合）或“遮蓋”了抗原決定簇，使之抗原性減弱或消除,酶 分 子 修 飾,修飾酶的特性總結(jié) 酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 絕大多數(shù)酶經(jīng)修飾后最大反應(yīng)速度 Vmax 沒(méi)有變化 有些酶在修飾后，米氏常數(shù) Km 通常會(huì)增大，這可能是交聯(lián)于酶上的大分子所產(chǎn)生的空間障礙影響了底物對(duì)酶的接近和結(jié)合 修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強(qiáng)和體內(nèi)半衰期的延長(zhǎng)，能夠彌補(bǔ) Km 增大的缺陷,酶 分 子 修 飾,修飾酶的特性總結(jié) 對(duì)組織的分布能力變化 某些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，對(duì)組織的分布能力有所改變，能在血液中被一些器官選擇性地吸收 例1：-葡萄糖苷酶 Pompe ?。ㄌ窃A積 II 型）主要是由于糖原貯積于肝細(xì)胞的二級(jí)溶酶體造成的，用 -葡萄糖苷酶治療時(shí)希望酶能盡快到達(dá)肝細(xì)胞處，