第五章 植物的胚胎培養(yǎng)及離體.ppt

1、31 第五章 植物的胚胎培養(yǎng)及離體授粉,Hanning (1904) 最早在無(wú)菌條件下進(jìn)行十字花科辣根菜、蘿卜成熟胚培養(yǎng)獲得成功。 Laibach (1925，1929)用宿根亞麻奧地利亞麻（Linum perenne L.austriacum）胚培養(yǎng)，得到了雜種植物。因?yàn)樵谶h(yuǎn)緣雜交的組合中，植物所結(jié)的種子發(fā)育不良，不能萌發(fā)?？蓪⑴咧糜谌斯づ囵B(yǎng)基上培養(yǎng)成功。 在高等植物種間或?qū)匍g遠(yuǎn)緣雜交時(shí)的問(wèn)題: 由于不親和性，常常還會(huì)發(fā)生花粉不能在異種植物柱頭上萌發(fā)或花粉管生長(zhǎng)受到抑制不能進(jìn)入子房的受精前障礙。 或即使受精，由于胚乳發(fā)育不良或因胚與胚乳間不親和而使胚在早期敗育。胚胎培養(yǎng)可以在胚乳發(fā)育不良時(shí)，

2、把胚在早期及時(shí)取出培養(yǎng)，有可能獲得雜交的成功。,第一節(jié) 植物胚胎培養(yǎng)的類型和應(yīng)用,植物胚胎培養(yǎng)（Embryo culture）是指胚和胚器官（子房、胚珠）在離體條件下培養(yǎng)發(fā)育成完整植株的技術(shù)。 一、胚培養(yǎng)類型 兩類:幼胚與成熟胚培養(yǎng) 成熟胚一般在比較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基上就能萌發(fā)生長(zhǎng)，成熟 胚生長(zhǎng)依賴胚乳、子葉的貯藏營(yíng)養(yǎng)，培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單。只要 提供合適的生長(zhǎng)條件以及打破休眠，即可萌發(fā)成幼苗。 成熟胚培養(yǎng)技術(shù)要求不嚴(yán)格，將受精后的果實(shí)或種子（帶 種皮），表面消毒后，剝?nèi)》N胚,接種于培養(yǎng)基上，即可發(fā) 育成為一個(gè)完整的植物體。,幼胚指尚未成熟（發(fā)育早期）的胚。在離體培養(yǎng)時(shí)比成熟胚培養(yǎng)困難，要求的技術(shù)和條件較

3、高。 幼胚離體培養(yǎng)有兩種不同的生長(zhǎng)方式： 1)繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持胚性生長(zhǎng)。 2)迅速萌發(fā)為幼苗，不維持胚性生長(zhǎng)，這種情況稱為“早熟萌發(fā)”（precocious germination）。早熟萌發(fā)形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至引起死亡。,二 、培養(yǎng)方法,1、材料的選擇與滅菌 取回大田或溫室里種植的雜交植物的子房，用70%的酒精進(jìn)行幾秒鐘表面消毒，再用0.1% HgCl2滅菌1030min，無(wú)菌水沖洗，即可用于外植體的分離和培養(yǎng)。,2、幼胚的分離及培養(yǎng),幼胚的剝離 幼胚的培養(yǎng) 胚胎發(fā)育過(guò)程分為兩個(gè)時(shí)期： 1）異養(yǎng)期（heterotrophy period），即在胚發(fā)育早期，幼胚由胚乳及周圍

4、的組織提供養(yǎng)分。 2）自養(yǎng)期(autotrophy period) ，胚在代謝上已經(jīng)能在基本的無(wú)機(jī)鹽和蔗糖的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在營(yíng)養(yǎng)上已相當(dāng)獨(dú)立。,Monnier(1976,1978)介紹了一種培養(yǎng)方法,胚乳看護(hù)培養(yǎng) Ziebur等 (1951)報(bào)道，在進(jìn)行大麥未成熟胚離體培養(yǎng) 時(shí)，培養(yǎng)基上存在來(lái)自同一物種另一種子的離體胚乳，對(duì)胚 的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。 谷類胚胎嫁接的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大麥胚移植到小麥的胚乳上 時(shí)，比在大麥胚乳上生長(zhǎng)更好。 Kruse(1974)在某些屬間雜交中，若把雜交未成熟的胚放 在事先培養(yǎng)的大麥胚乳上培養(yǎng)，能顯著提高獲得雜種植株的 頻率。 大麥（Hordeum vulgar

5、e）黑麥(Secale cereale)屬間雜交，采用這種方法有30%40%的雜種未成熟胚可以發(fā)育成苗，而用傳統(tǒng)的胚培養(yǎng)法只有1%能成功。,De lautour等（1980）改良胚乳看護(hù)培養(yǎng)（圖4-2）。他們把雜種離體幼胚嵌入到由雙親之一胚乳中，然后把二者一起放在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。,三、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用,1克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性 在遠(yuǎn)緣雜交中，由于雙親遺傳和生理的不親和性，產(chǎn)生受精障礙或胚乳不能正常發(fā)育，導(dǎo)致雜種發(fā)育不良或早期夭折。利用胚胎培養(yǎng)或分離早期幼胚培養(yǎng)，在試管中培養(yǎng)成再生植株，可防止遠(yuǎn)緣雜交中優(yōu)良種質(zhì)的丟失。 2打破種子休眠 一些種子發(fā)育不完全或有抑制物存在而影響種胚發(fā)芽。利用含有糖和無(wú)

6、機(jī)鹽的培養(yǎng)基進(jìn)行胚培養(yǎng)，可使這些植物的幼胚達(dá)到生理和形態(tài)上的成熟而萌發(fā)成植株。 3縮短育種周期 常規(guī)育種和胚培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可縮短育種時(shí)間。 4克服種子的自然不育性 長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖的植物，雖然具有形成種子的能力，但種子生活力較低。胚培養(yǎng)有可能促進(jìn)這類種子萌發(fā)和形成幼苗。,四、影響胚培養(yǎng)的因素,（一）、培養(yǎng)基： 1無(wú)機(jī)鹽 成熟胚的培養(yǎng)基較簡(jiǎn)單。主要有Turkey、Randolph、white等. 以大量元素和微量元素的無(wú)機(jī)鹽為基本成分。 幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基為常用的MS、B5、Nitsch以及Rijven、Rangaswang、Norstog等培養(yǎng)基。,2碳水化合物糖在胚培養(yǎng)中具有三個(gè)方面的作用：調(diào)節(jié)

7、培養(yǎng)基的滲透壓、作為碳源和能源、防止幼胚的早熟萌發(fā)。,成熟胚在低濃度（含2%）蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)很好。但幼胚 要求較高水平的碳水化合物。 未成熟胚加入蔗糖的最重要的作用是保持培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)臐B透壓。如果蔗糖濃度過(guò)低易引起胚胎過(guò)早萌發(fā)。 Paris等（1953）在培養(yǎng)小于0.3mm的曼陀羅(D stramonium)胚時(shí)，發(fā)現(xiàn)其適宜的蔗糖濃度為5%，而較低的蔗糖濃度對(duì)較大的成熟胚生長(zhǎng)適合。,3其它成分 氨基酸：谷氨酰胺、水解酪蛋白被廣泛。 維生素類：有硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣等。維生素對(duì)發(fā)育初期的幼胚的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)是必須的。 外源激素：成熟胚生長(zhǎng)一般不需要即可萌發(fā)，而加入一定量的激素可顯著增加培養(yǎng)物

8、的生長(zhǎng)、并利于休眠種胚的萌發(fā)。 外源生長(zhǎng)物質(zhì)和植物內(nèi)源激素之間某種平衡，是維持幼胚胚性生長(zhǎng)的關(guān)鍵。如果激素濃度低，則不能促進(jìn)其生長(zhǎng)；如果激素濃度過(guò)高，將會(huì)使幼胚發(fā)生脫分化而影響其正常發(fā)育。 天然提取物：如椰乳、大麥胚乳、麥芽、馬鈴薯塊、大豆等提取物，對(duì)胚生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。 Van Overbeek等使用椰子汁培養(yǎng)曼陀羅的心形胚獲得成功。 王伏雄（1963）發(fā)現(xiàn)蜂王漿對(duì)銀杏幼胚正常分化有促進(jìn)作用、胚 的死亡率減少、抑制胚形成愈傷組織。,（二）、環(huán)境條件 1溫度 對(duì)大多數(shù)植物胚的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，溫度保持在2530較為合適。 而在20下馬鈴薯胚培養(yǎng)較好。在2530范圍內(nèi)柑橘、蘋果、梨合適。 32時(shí)棉花胚生長(zhǎng)

9、最好。桃則需要變溫條件下進(jìn)行。 2光照 光對(duì)胚胎發(fā)育有抑制作用，一般黑暗或弱光下利于幼 胚的培養(yǎng)。 （三）、 胚柄對(duì)幼胚培養(yǎng)的影響 研究表明，胚柄參與幼胚的發(fā)育過(guò)程。當(dāng)胚發(fā)育到球形期時(shí)， 胚柄也發(fā)育到最大。 紅花菜豆中，較老的胚，不管有無(wú)胚柄的存在，均能在培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)；但幼胚培養(yǎng)，不帶胚柄會(huì)顯著降低形成小植株的頻率。,胚乳培養(yǎng)(endosperm culture)是指將胚乳組織從母體上分離出來(lái)，通過(guò)離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的過(guò)程。 裸子植物中胚乳是由雌配子體發(fā)育而成的，是單倍體。 被子植物中胚乳一般是雙受精的產(chǎn)物，是由兩個(gè)極核和一個(gè)雄配子融合而成的三倍體。 而待宵草型胚囊只有一個(gè)極核與精

10、細(xì)胞融合，胚乳為2n。,第二節(jié) 植物胚乳的培養(yǎng),一、 培養(yǎng)方法,（一）胚乳外植體的制備 將整個(gè)果實(shí)進(jìn)行表面消毒，在無(wú)菌條件下切開幼果，取出種子，小心分離胚乳，接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 （二）胚乳愈傷組織再生植株 1愈傷組織的誘導(dǎo) 少數(shù)植物可以直接從胚乳分化出器官外，大多數(shù)被子植物的胚乳，無(wú)論是未成熟或成熟的，都首先形成愈傷組織，然后分化植株。 2器官發(fā)生途徑 器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型均有。,（三） 三倍體后代的特征 1形態(tài)特征： 粗壯，葉片大而肥厚，葉色濃，花型大或重瓣，果實(shí)大但結(jié)實(shí)率低。 2胚乳再生植株的倍性 在胚乳培養(yǎng)中常常發(fā)生染色體倍性的混亂現(xiàn)象。即多數(shù)胚乳培養(yǎng)具有多種數(shù)目的染色體細(xì)胞組成。

11、黃貞光等（1982）報(bào)道，來(lái)源于獼猴桃同一植株的胚乳，可以培養(yǎng)出三倍體和二倍體兩種倍性的植株。 影響胚乳細(xì)胞在培養(yǎng)中染色體穩(wěn)定性的因素主要有： 胚乳的類型、胚乳愈傷組織發(fā)生的部位以及培養(yǎng)基中外源激素的種類和水平。,二、影響胚乳培養(yǎng)的因素,1培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 1）常用的基本培養(yǎng)基有MT、LS、MS等。 2）添加有機(jī)物，如水解酪蛋白和酵母提取物 3）同時(shí)加入細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，愈傷組織正常生長(zhǎng)，其效果顯著優(yōu)于使用單一的生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素。 4）蔗糖的濃度一般為3%5% 。 5）適宜培養(yǎng)溫度為25左右,2胚在胚乳培養(yǎng)中的作用,胚乳培養(yǎng)中，分為：帶胚培養(yǎng)、不帶胚培養(yǎng)兩種方式。 帶胚培養(yǎng)胚乳比不帶胚的胚

12、乳組織容易形成愈傷組織，當(dāng)愈傷組織形成后，除去胚并不影響胚乳組織的增殖。 未成熟胚乳，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上沒(méi)有胚的存在就能形成愈傷組織。而成熟的胚乳，必須借助于胚的萌發(fā)使其活化。胚對(duì)胚乳組織的增殖作用，被認(rèn)為是某種“胚性因子”在起作用。這種“胚性因子”可能就是赤霉素。,三、胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用,1）三倍體幼苗和植株的獲得，對(duì)于一些無(wú)性繁殖的植物具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 2）胚乳植株染色體的不穩(wěn)定性，為染色體工程的研究提供有效的途徑。 3）為研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等產(chǎn)物的生物合成及其代謝，提供了良好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。,第三節(jié) 植物胚珠和子房培養(yǎng),一、胚珠培養(yǎng) 胚珠培養(yǎng)是將授粉的子房在無(wú)菌的條件下解剖后，取出胚 珠置于培

13、養(yǎng)基培養(yǎng)的過(guò)程。 胚珠是種子植物的大孢子囊，是孕育雌配子體的場(chǎng)所，也是 種子形成的前身。 根據(jù)培養(yǎng)胚珠的不同目的，可將胚珠培養(yǎng)分為受精胚珠的培 養(yǎng)和未受精胚珠的培養(yǎng)兩種形式。,（一）胚珠培養(yǎng)的意義 1利用胚珠培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)雜種在胚珠時(shí)期開始培養(yǎng)，可獲得雜種植株，防止雜種胚早期敗育。 2用未受精的胚珠培養(yǎng)以及未受精的胎座或子房培養(yǎng)可以作為試管受精的技術(shù)基礎(chǔ)。 3在未受精的胚珠培養(yǎng)中可以誘導(dǎo)單倍體植株。,（二）胚珠培養(yǎng)方法 1材料的選擇和滅菌 培養(yǎng)受精胚珠，取回授粉時(shí)間合適的子房；培養(yǎng)未受精的胚珠，則應(yīng)在授粉前適當(dāng)時(shí)間摘取子房。 進(jìn)行常規(guī)表面消毒后，剝離子房，縱切開子房，將胚珠一個(gè)個(gè)取出來(lái)，或者將帶

14、有胎座部分的胚珠一起取下接種。 2. 胎座和子房對(duì)胚珠培養(yǎng)的影響 帶有胎座或子房的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，所需培養(yǎng)基較簡(jiǎn)單，而且受精后不久的胚珠也容易發(fā)育成種子。因此，在進(jìn)行單個(gè)胚珠培養(yǎng)不能成功時(shí)，常可考慮用帶有胎座或子房一起進(jìn)行培養(yǎng)。,二、子房培養(yǎng) 子房培養(yǎng)是指將子房從母體上分離下來(lái)，放在人工配制的培 養(yǎng)基上，使其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育成為幼苗的過(guò)程。 子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座、胚珠組成。 （一）培養(yǎng)方法 1子房外植體的制備 子房培養(yǎng)的程序和方法與胚珠培養(yǎng)相似 2. 培養(yǎng)子房的發(fā)育 子房存在兩種細(xì)胞，即性細(xì)胞和體細(xì)胞，它們都可產(chǎn)生胚狀 體或愈傷組織，進(jìn)一步發(fā)育成不同倍性的植株。 胚囊里的雌配

15、子體的核是由大孢子母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂發(fā)育 而來(lái)，產(chǎn)生的植株是單倍體。 如來(lái)源于體細(xì)胞，即由珠被和子房壁表皮二倍體組織產(chǎn)生的 植株，屬于二倍體植株。,（二）影響子房培養(yǎng)的因素 受精前或受精后植物的子房，通過(guò)離體培養(yǎng)，都可形成果實(shí)，并得到成熟的種子。這種培養(yǎng)方式所要求的培養(yǎng)基也較簡(jiǎn)單，常用的培養(yǎng)基有N6、MS、NB等。 使子房性細(xì)胞和體細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)胚狀體或愈傷組織，并分化成植株，則對(duì)培養(yǎng)基的成分有一定的要求。如誘導(dǎo)未受精子房胚囊核單倍體組織發(fā)生，就需要在培養(yǎng)基中加入一定量的外源激素。,第四節(jié) 植物離體受精,一、植物受精 （一）植物離體授粉（pollination in vitro) 指將未授粉的胚

16、珠、子房或柱頭從母體上分離下來(lái)，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，并通過(guò)一定的方式授給無(wú)菌花粉，使其在試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精的技術(shù)，又稱為試管受精或離體受精（fertilization in vitro)。 優(yōu)點(diǎn)： 離體授粉技術(shù)可以克服遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中受精前障礙， 獲得可育性種子。 （二）根據(jù)授粉的部位分為三種離體受精技術(shù)： 胚珠授粉、子房授粉、柱頭授粉。,1、離體柱頭授粉： 將無(wú)菌花粉授于離體培養(yǎng)的雌蕊（未受精的）柱頭上，得到含 有可育性種子或果實(shí)的技術(shù),又稱為雌蕊離體授粉。 2、離體子房授粉： 在離體條件下，將無(wú)菌花粉直接引入子房中，使花粉粒在子房 中萌發(fā)、完成受精，并獲得具有生活力的種子的技術(shù)。 花粉粒引入子房中的方法： 直接引入法：在子房切口處，放入花粉粒。 注射法：將花粉粒用硼酸配成懸浮液，用無(wú)菌注射器注入子房中。 3、離體胚珠授粉： 在離體條件下，將無(wú)菌花粉在未受精的胚珠上授粉，得到可育 性種子的過(guò)程。,（三）離體受精的方法 1、試驗(yàn)材料的選擇 實(shí)驗(yàn)最好選用子房較大并有多個(gè)胚珠的植物。 保留母體花器官組織有利于成功的離體受精。 2離體受精的一般程序 離體受粉程序是：確定開花、花藥開裂的時(shí)間；去雄后將花蕾套袋隔離；制備子房或胚珠、采集花粉；試管授粉。 采集花粉：尚未開裂的花藥可從花蕾中取出，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中直到花藥開裂；已開放的花中的花藥，首先要進(jìn)行表面消