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文檔簡介

1、31 第五章 植物的胚胎培養(yǎng)及離體授粉,Hanning (1904) 最早在無菌條件下進行十字花科辣根菜、蘿卜成熟胚培養(yǎng)獲得成功。 Laibach (1925,1929)用宿根亞麻奧地利亞麻(Linum perenne L.austriacum)胚培養(yǎng),得到了雜種植物。因為在遠緣雜交的組合中,植物所結(jié)的種子發(fā)育不良,不能萌發(fā)??蓪⑴咧糜谌斯づ囵B(yǎng)基上培養(yǎng)成功。 在高等植物種間或?qū)匍g遠緣雜交時的問題: 由于不親和性,常常還會發(fā)生花粉不能在異種植物柱頭上萌發(fā)或花粉管生長受到抑制不能進入子房的受精前障礙。 或即使受精,由于胚乳發(fā)育不良或因胚與胚乳間不親和而使胚在早期敗育。胚胎培養(yǎng)可以在胚乳發(fā)育不良時,

2、把胚在早期及時取出培養(yǎng),有可能獲得雜交的成功。,第一節(jié) 植物胚胎培養(yǎng)的類型和應(yīng)用,植物胚胎培養(yǎng)(Embryo culture)是指胚和胚器官(子房、胚珠)在離體條件下培養(yǎng)發(fā)育成完整植株的技術(shù)。 一、胚培養(yǎng)類型 兩類:幼胚與成熟胚培養(yǎng) 成熟胚一般在比較簡單的培養(yǎng)基上就能萌發(fā)生長,成熟 胚生長依賴胚乳、子葉的貯藏營養(yǎng),培養(yǎng)基要求簡單。只要 提供合適的生長條件以及打破休眠,即可萌發(fā)成幼苗。 成熟胚培養(yǎng)技術(shù)要求不嚴格,將受精后的果實或種子(帶 種皮),表面消毒后,剝?nèi)》N胚,接種于培養(yǎng)基上,即可發(fā) 育成為一個完整的植物體。,幼胚指尚未成熟(發(fā)育早期)的胚。在離體培養(yǎng)時比成熟胚培養(yǎng)困難,要求的技術(shù)和條件較

3、高。 幼胚離體培養(yǎng)有兩種不同的生長方式: 1)繼續(xù)進行正常的胚胎發(fā)育,維持胚性生長。 2)迅速萌發(fā)為幼苗,不維持胚性生長,這種情況稱為“早熟萌發(fā)”(precocious germination)。早熟萌發(fā)形成的幼苗往往畸形瘦弱,甚至引起死亡。,二 、培養(yǎng)方法,1、材料的選擇與滅菌 取回大田或溫室里種植的雜交植物的子房,用70%的酒精進行幾秒鐘表面消毒,再用0.1% HgCl2滅菌1030min,無菌水沖洗,即可用于外植體的分離和培養(yǎng)。,2、幼胚的分離及培養(yǎng),幼胚的剝離 幼胚的培養(yǎng) 胚胎發(fā)育過程分為兩個時期: 1)異養(yǎng)期(heterotrophy period),即在胚發(fā)育早期,幼胚由胚乳及周圍

4、的組織提供養(yǎng)分。 2)自養(yǎng)期(autotrophy period) ,胚在代謝上已經(jīng)能在基本的無機鹽和蔗糖的合成培養(yǎng)基上生長,在營養(yǎng)上已相當獨立。,Monnier(1976,1978)介紹了一種培養(yǎng)方法,胚乳看護培養(yǎng) Ziebur等 (1951)報道,在進行大麥未成熟胚離體培養(yǎng) 時,培養(yǎng)基上存在來自同一物種另一種子的離體胚乳,對胚 的生長有明顯的促進作用。 谷類胚胎嫁接的研究發(fā)現(xiàn),當大麥胚移植到小麥的胚乳上 時,比在大麥胚乳上生長更好。 Kruse(1974)在某些屬間雜交中,若把雜交未成熟的胚放 在事先培養(yǎng)的大麥胚乳上培養(yǎng),能顯著提高獲得雜種植株的 頻率。 大麥(Hordeum vulgar

5、e)黑麥(Secale cereale)屬間雜交,采用這種方法有30%40%的雜種未成熟胚可以發(fā)育成苗,而用傳統(tǒng)的胚培養(yǎng)法只有1%能成功。,De lautour等(1980)改良胚乳看護培養(yǎng)(圖4-2)。他們把雜種離體幼胚嵌入到由雙親之一胚乳中,然后把二者一起放在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。,三、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用,1克服遠緣雜交不親和性 在遠緣雜交中,由于雙親遺傳和生理的不親和性,產(chǎn)生受精障礙或胚乳不能正常發(fā)育,導致雜種發(fā)育不良或早期夭折。利用胚胎培養(yǎng)或分離早期幼胚培養(yǎng),在試管中培養(yǎng)成再生植株,可防止遠緣雜交中優(yōu)良種質(zhì)的丟失。 2打破種子休眠 一些種子發(fā)育不完全或有抑制物存在而影響種胚發(fā)芽。利用含有糖和無

6、機鹽的培養(yǎng)基進行胚培養(yǎng),可使這些植物的幼胚達到生理和形態(tài)上的成熟而萌發(fā)成植株。 3縮短育種周期 常規(guī)育種和胚培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合,可縮短育種時間。 4克服種子的自然不育性 長期營養(yǎng)繁殖的植物,雖然具有形成種子的能力,但種子生活力較低。胚培養(yǎng)有可能促進這類種子萌發(fā)和形成幼苗。,四、影響胚培養(yǎng)的因素,(一)、培養(yǎng)基: 1無機鹽 成熟胚的培養(yǎng)基較簡單。主要有Turkey、Randolph、white等. 以大量元素和微量元素的無機鹽為基本成分。 幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基為常用的MS、B5、Nitsch以及Rijven、Rangaswang、Norstog等培養(yǎng)基。,2碳水化合物糖在胚培養(yǎng)中具有三個方面的作用:調(diào)節(jié)

7、培養(yǎng)基的滲透壓、作為碳源和能源、防止幼胚的早熟萌發(fā)。,成熟胚在低濃度(含2%)蔗糖的培養(yǎng)基中生長很好。但幼胚 要求較高水平的碳水化合物。 未成熟胚加入蔗糖的最重要的作用是保持培養(yǎng)基適當?shù)臐B透壓。如果蔗糖濃度過低易引起胚胎過早萌發(fā)。 Paris等(1953)在培養(yǎng)小于0.3mm的曼陀羅(D stramonium)胚時,發(fā)現(xiàn)其適宜的蔗糖濃度為5%,而較低的蔗糖濃度對較大的成熟胚生長適合。,3其它成分 氨基酸:谷氨酰胺、水解酪蛋白被廣泛。 維生素類:有硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣等。維生素對發(fā)育初期的幼胚的培養(yǎng)來說是必須的。 外源激素:成熟胚生長一般不需要即可萌發(fā),而加入一定量的激素可顯著增加培養(yǎng)物

8、的生長、并利于休眠種胚的萌發(fā)。 外源生長物質(zhì)和植物內(nèi)源激素之間某種平衡,是維持幼胚胚性生長的關(guān)鍵。如果激素濃度低,則不能促進其生長;如果激素濃度過高,將會使幼胚發(fā)生脫分化而影響其正常發(fā)育。 天然提取物:如椰乳、大麥胚乳、麥芽、馬鈴薯塊、大豆等提取物,對胚生長有促進作用。 Van Overbeek等使用椰子汁培養(yǎng)曼陀羅的心形胚獲得成功。 王伏雄(1963)發(fā)現(xiàn)蜂王漿對銀杏幼胚正常分化有促進作用、胚 的死亡率減少、抑制胚形成愈傷組織。,(二)、環(huán)境條件 1溫度 對大多數(shù)植物胚的培養(yǎng)來說,溫度保持在2530較為合適。 而在20下馬鈴薯胚培養(yǎng)較好。在2530范圍內(nèi)柑橘、蘋果、梨合適。 32時棉花胚生長

9、最好。桃則需要變溫條件下進行。 2光照 光對胚胎發(fā)育有抑制作用,一般黑暗或弱光下利于幼 胚的培養(yǎng)。 (三)、 胚柄對幼胚培養(yǎng)的影響 研究表明,胚柄參與幼胚的發(fā)育過程。當胚發(fā)育到球形期時, 胚柄也發(fā)育到最大。 紅花菜豆中,較老的胚,不管有無胚柄的存在,均能在培養(yǎng)基 中生長;但幼胚培養(yǎng),不帶胚柄會顯著降低形成小植株的頻率。,胚乳培養(yǎng)(endosperm culture)是指將胚乳組織從母體上分離出來,通過離體培養(yǎng),使其發(fā)育成完整植株的過程。 裸子植物中胚乳是由雌配子體發(fā)育而成的,是單倍體。 被子植物中胚乳一般是雙受精的產(chǎn)物,是由兩個極核和一個雄配子融合而成的三倍體。 而待宵草型胚囊只有一個極核與精

10、細胞融合,胚乳為2n。,第二節(jié) 植物胚乳的培養(yǎng),一、 培養(yǎng)方法,(一)胚乳外植體的制備 將整個果實進行表面消毒,在無菌條件下切開幼果,取出種子,小心分離胚乳,接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 (二)胚乳愈傷組織再生植株 1愈傷組織的誘導 少數(shù)植物可以直接從胚乳分化出器官外,大多數(shù)被子植物的胚乳,無論是未成熟或成熟的,都首先形成愈傷組織,然后分化植株。 2器官發(fā)生途徑 器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型均有。,(三) 三倍體后代的特征 1形態(tài)特征: 粗壯,葉片大而肥厚,葉色濃,花型大或重瓣,果實大但結(jié)實率低。 2胚乳再生植株的倍性 在胚乳培養(yǎng)中常常發(fā)生染色體倍性的混亂現(xiàn)象。即多數(shù)胚乳培養(yǎng)具有多種數(shù)目的染色體細胞組成。

11、黃貞光等(1982)報道,來源于獼猴桃同一植株的胚乳,可以培養(yǎng)出三倍體和二倍體兩種倍性的植株。 影響胚乳細胞在培養(yǎng)中染色體穩(wěn)定性的因素主要有: 胚乳的類型、胚乳愈傷組織發(fā)生的部位以及培養(yǎng)基中外源激素的種類和水平。,二、影響胚乳培養(yǎng)的因素,1培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 1)常用的基本培養(yǎng)基有MT、LS、MS等。 2)添加有機物,如水解酪蛋白和酵母提取物 3)同時加入細胞分裂素和生長素,愈傷組織正常生長,其效果顯著優(yōu)于使用單一的生長素或細胞分裂素。 4)蔗糖的濃度一般為3%5% 。 5)適宜培養(yǎng)溫度為25左右,2胚在胚乳培養(yǎng)中的作用,胚乳培養(yǎng)中,分為:帶胚培養(yǎng)、不帶胚培養(yǎng)兩種方式。 帶胚培養(yǎng)胚乳比不帶胚的胚

12、乳組織容易形成愈傷組織,當愈傷組織形成后,除去胚并不影響胚乳組織的增殖。 未成熟胚乳,在誘導培養(yǎng)基上沒有胚的存在就能形成愈傷組織。而成熟的胚乳,必須借助于胚的萌發(fā)使其活化。胚對胚乳組織的增殖作用,被認為是某種“胚性因子”在起作用。這種“胚性因子”可能就是赤霉素。,三、胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用,1)三倍體幼苗和植株的獲得,對于一些無性繁殖的植物具有重要經(jīng)濟價值。 2)胚乳植株染色體的不穩(wěn)定性,為染色體工程的研究提供有效的途徑。 3)為研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等產(chǎn)物的生物合成及其代謝,提供了良好的實驗系統(tǒng)。,第三節(jié) 植物胚珠和子房培養(yǎng),一、胚珠培養(yǎng) 胚珠培養(yǎng)是將授粉的子房在無菌的條件下解剖后,取出胚 珠置于培

13、養(yǎng)基培養(yǎng)的過程。 胚珠是種子植物的大孢子囊,是孕育雌配子體的場所,也是 種子形成的前身。 根據(jù)培養(yǎng)胚珠的不同目的,可將胚珠培養(yǎng)分為受精胚珠的培 養(yǎng)和未受精胚珠的培養(yǎng)兩種形式。,(一)胚珠培養(yǎng)的意義 1利用胚珠培養(yǎng)技術(shù),對雜種在胚珠時期開始培養(yǎng),可獲得雜種植株,防止雜種胚早期敗育。 2用未受精的胚珠培養(yǎng)以及未受精的胎座或子房培養(yǎng)可以作為試管受精的技術(shù)基礎(chǔ)。 3在未受精的胚珠培養(yǎng)中可以誘導單倍體植株。,(二)胚珠培養(yǎng)方法 1材料的選擇和滅菌 培養(yǎng)受精胚珠,取回授粉時間合適的子房;培養(yǎng)未受精的胚珠,則應(yīng)在授粉前適當時間摘取子房。 進行常規(guī)表面消毒后,剝離子房,縱切開子房,將胚珠一個個取出來,或者將帶

14、有胎座部分的胚珠一起取下接種。 2. 胎座和子房對胚珠培養(yǎng)的影響 帶有胎座或子房的胚珠進行培養(yǎng)時,所需培養(yǎng)基較簡單,而且受精后不久的胚珠也容易發(fā)育成種子。因此,在進行單個胚珠培養(yǎng)不能成功時,??煽紤]用帶有胎座或子房一起進行培養(yǎng)。,二、子房培養(yǎng) 子房培養(yǎng)是指將子房從母體上分離下來,放在人工配制的培 養(yǎng)基上,使其進一步生長發(fā)育成為幼苗的過程。 子房是雌蕊基部膨大的部分,由子房壁、胎座、胚珠組成。 (一)培養(yǎng)方法 1子房外植體的制備 子房培養(yǎng)的程序和方法與胚珠培養(yǎng)相似 2. 培養(yǎng)子房的發(fā)育 子房存在兩種細胞,即性細胞和體細胞,它們都可產(chǎn)生胚狀 體或愈傷組織,進一步發(fā)育成不同倍性的植株。 胚囊里的雌配

15、子體的核是由大孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂發(fā)育 而來,產(chǎn)生的植株是單倍體。 如來源于體細胞,即由珠被和子房壁表皮二倍體組織產(chǎn)生的 植株,屬于二倍體植株。,(二)影響子房培養(yǎng)的因素 受精前或受精后植物的子房,通過離體培養(yǎng),都可形成果實,并得到成熟的種子。這種培養(yǎng)方式所要求的培養(yǎng)基也較簡單,常用的培養(yǎng)基有N6、MS、NB等。 使子房性細胞和體細胞通過誘導胚狀體或愈傷組織,并分化成植株,則對培養(yǎng)基的成分有一定的要求。如誘導未受精子房胚囊核單倍體組織發(fā)生,就需要在培養(yǎng)基中加入一定量的外源激素。,第四節(jié) 植物離體受精,一、植物受精 (一)植物離體授粉(pollination in vitro) 指將未授粉的胚

16、珠、子房或柱頭從母體上分離下來,進行無菌培養(yǎng),并通過一定的方式授給無菌花粉,使其在試管內(nèi)實現(xiàn)受精的技術(shù),又稱為試管受精或離體受精(fertilization in vitro)。 優(yōu)點: 離體授粉技術(shù)可以克服遠緣雜交過程中受精前障礙, 獲得可育性種子。 (二)根據(jù)授粉的部位分為三種離體受精技術(shù): 胚珠授粉、子房授粉、柱頭授粉。,1、離體柱頭授粉: 將無菌花粉授于離體培養(yǎng)的雌蕊(未受精的)柱頭上,得到含 有可育性種子或果實的技術(shù),又稱為雌蕊離體授粉。 2、離體子房授粉: 在離體條件下,將無菌花粉直接引入子房中,使花粉粒在子房 中萌發(fā)、完成受精,并獲得具有生活力的種子的技術(shù)。 花粉粒引入子房中的方法: 直接引入法:在子房切口處,放入花粉粒。 注射法:將花粉粒用硼酸配成懸浮液,用無菌注射器注入子房中。 3、離體胚珠授粉: 在離體條件下,將無菌花粉在未受精的胚珠上授粉,得到可育 性種子的過程。,(三)離體受精的方法 1、試驗材料的選擇 實驗最好選用子房較大并有多個胚珠的植物。 保留母體花器官組織有利于成功的離體受精。 2離體受精的一般程序 離體受粉程序是:確定開花、花藥開裂的時間;去雄后將花蕾套袋隔離;制備子房或胚珠、采集花粉;試管授粉。 采集花粉:尚未開裂的花藥可從花蕾中取出,置于無菌的培養(yǎng)皿中直到花藥開裂;已開放的花中的花藥,首先要進行表面消

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