LC-MS原理詳細(xì)講解PPT.ppt

1、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用,樂山CDC檢驗所,為什么需要MS?,色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。 色譜質(zhì)譜聯(lián)用包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用互為補(bǔ)充，分析不同性質(zhì)的化合物。,為什么LC需要MS-MS聯(lián)用而GC不需要？,液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:,氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解

2、決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。,現(xiàn)代有機(jī)和生物質(zhì)譜進(jìn)展,在20世紀(jì)80及90年代，質(zhì)譜法經(jīng)歷了兩次飛躍。在此之前，質(zhì)譜法通常只能測定分子量500Da以下的小分子化合物。20世紀(jì)70年代，出現(xiàn)了場解吸（FD）離子化技術(shù)，能夠測定分子量高達(dá)15002000Da的非揮發(fā)性化合物，但重復(fù)性差。20世紀(jì)80年代初發(fā)明了快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），能夠分析分子量達(dá)數(shù)千的多肽。 隨著生命科學(xué)的發(fā)展，欲分析的樣品更加復(fù)雜，分子量范圍也更大

3、，因此，電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法（MALDI-MS）應(yīng)運(yùn)而生。,目前的有機(jī)質(zhì)譜和生物質(zhì)譜儀，除了GC-MS的EI和CI源，離子化方式有大氣壓電離（API）（包括大氣壓電噴霧電離ESI、大氣壓化學(xué)電離APCI、大氣壓光電離APPI）與基質(zhì)輔助激光解吸電離。前者常采用四極桿或離子阱質(zhì)量分析器，統(tǒng)稱API-MS。后者常用飛行時間作為質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特點(diǎn)是可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離手段聯(lián)用，擴(kuò)展了應(yīng)用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析、食品檢驗、組合化學(xué)、有機(jī)

4、化學(xué)的應(yīng)用等；MALDI-TOF-MS的特點(diǎn)是對鹽和添加物的耐受能力高，且測樣速度快，操作簡單。,質(zhì)譜原理簡介：,質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所作的條狀圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。,常見術(shù)語:,質(zhì)荷比: 離子質(zhì)量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z. 峰: 質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰. 離子豐度: 檢測器檢測到的離子信號強(qiáng)度. 基峰: 在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強(qiáng)度最大的離子峰稱作基峰. 總離子流圖；質(zhì)量色譜圖；準(zhǔn)分

5、子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子,總離子流圖:,在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強(qiáng)度的總和對時間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱TIC圖.,質(zhì)量色譜圖,指定某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的離子其強(qiáng)度對時間所作的圖. 利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時是LC/MS測定中最有用的方式。當(dāng)樣品濃度很低時LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時，根據(jù)得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數(shù)值，觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖，檢驗直接進(jìn)樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適，以后進(jìn)行MRM等其他掃描方式的測定時可作為參考。,質(zhì)量色譜圖,總離子流圖,準(zhǔn)分子離子:,指與分子存在

6、簡單關(guān)系的離子，通過它可以確定分子量.液質(zhì)中最常見的準(zhǔn)分子離子峰是M+H+ 或M-H- . 在ESI中, 往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1,M+23,M+39,M+18.稱準(zhǔn)分子離子,表示為:M+H+,M+Na+等,碎片離子：,準(zhǔn)分子離子經(jīng)過一級或多級裂解生成的產(chǎn)物離子. 碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān),數(shù)目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。,Ephedrine, MW = 165,多電荷離子：,指帶有2個或更多電荷的離子,常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子.有機(jī)質(zhì)譜中,單電荷離子是絕大多數(shù),只有那些不容易碎裂的基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系

7、結(jié)構(gòu)-才會形成多電荷離子.它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的.采用電噴霧的離子化技術(shù), 可產(chǎn)生帶很多電荷 的離子,最后經(jīng)計 算機(jī)自動換算成單 質(zhì)/荷比離子。,同位素離子,由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子. 各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便, 還可利用穩(wěn)定同位素合成標(biāo)記化合物,如:氘等標(biāo)記化合物,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物,在質(zhì)譜圖外貌上無變化,只是質(zhì)量數(shù)的位移,從而說明化合物結(jié)構(gòu),反應(yīng)歷程等,有機(jī)質(zhì)譜的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn): (1)定分子量準(zhǔn)確，其它技術(shù)無法比。 (2)靈敏度高，常規(guī)10-710-8g,單離子檢測可達(dá)10-12g

8、。 (3)快速，幾分甚至幾秒。 (4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對于難分離的混合物特別有效, 其它技術(shù)無法勝任。 (5)多功能，廣泛適用于各類化合物。,局限性:,(1)異構(gòu)體，立體化學(xué)方面區(qū)分能力差。 (2)重復(fù)性稍差，要嚴(yán)格控制操作條件。 (3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，污染等問題。 (4)價格稍顯昂貴，操作有點(diǎn)復(fù)雜。,質(zhì)譜儀器：,質(zhì)譜儀由以下幾部分組成 數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 檢測接收器 真空系統(tǒng),真空系統(tǒng),質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。利用這個特點(diǎn)

9、，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而得到分子量。 由機(jī)械真空泵(前極低真空泵)，擴(kuò)散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機(jī)組，抽取離子源和分析器部分的真空。 只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度低。,進(jìn)樣系統(tǒng),把分析樣品導(dǎo)入離子源的裝置，包括：直接進(jìn)樣，GC，LC及接口，加熱進(jìn)樣，參考物進(jìn)樣等。,離子源,使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置，并對離子進(jìn)行加速使其進(jìn)入分析器，根據(jù)離子化方式的不同，有機(jī)質(zhì)譜中常用的有如下幾種，其中EI，ESI最常用。,EI(Electron Impact Ionization):電子轟擊電離硬電離。

10、 CI(Chemical Ionization):化學(xué)電離核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移。 FD(Field Desorption):場解吸目前基本被FAB取代。 FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轟擊或者銫離子 (LSIMS,液體二次離子質(zhì)譜 ) 。 ESI(Electrospray Ionization):電噴霧電離屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質(zhì)分子多肽等) APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大氣壓化學(xué)電離同上，更適宜做弱極性小分子。 APPI(Atmospheric Pressur

11、e PhotoSpray Ionization):大氣壓光噴霧電離同上，更適宜做非極性分子。 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時間質(zhì)譜和FT-MS，特別適合蛋白質(zhì)，多肽等大分子,其中ESI，APCI，APPI統(tǒng)稱大氣壓電離(API),實(shí)驗室現(xiàn)有的離子源:,ESI電噴霧電離源 APCI大氣壓化學(xué)電離源,電噴霧（ESI）的特點(diǎn),通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或M-H-單電荷離子，生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，由于質(zhì)譜儀測定質(zhì)/荷比，因此質(zhì)量范圍只有幾千質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀可測定質(zhì)量數(shù)十幾萬的生物大分子。 電噴霧電離是

12、最軟的電離技術(shù)，通常只產(chǎn)生分子離子峰，因此可直接測定混合物，并可測定熱不穩(wěn)定的極性化合物；其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子；通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂（源內(nèi)CID）測定化合物結(jié)構(gòu)。,大氣壓化學(xué)電離（APCI）特點(diǎn),大氣壓化學(xué)電離也是軟電離技術(shù)，只產(chǎn)生單電荷峰，適合測定質(zhì)量數(shù)小于2000Da的弱極性的小分子化合物；適應(yīng)高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動相；通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂。,電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較,電離機(jī)理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成MH+或M-H-離子。 樣品流速：APCI源可從0.2到2 mlmin

13、；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1 mlmin. 斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解. 靈敏度：通常認(rèn)為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。 多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子,正負(fù)離子模式:,一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負(fù)離子測定模式可供選擇。 根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇，也可兩種模式同時進(jìn)行,質(zhì)量分析器:,是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。,質(zhì)量分析器的分類：,雙聚焦扇形磁

14、場-電場串聯(lián)儀器(sector). 四極質(zhì)譜儀(Q). 飛行時間質(zhì)譜儀(TOF). 離子阱質(zhì)譜儀（TRAP） 付利葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS). 四極+TOF（Q-TOF） 串列式多級質(zhì)譜儀三重四極（QqQ） (MS/MS) TOF+TOF,進(jìn)行MS/MS的儀器從原理上可分為兩類,第一類儀器利用質(zhì)譜在空間中的順序，是由兩臺質(zhì)譜儀串聯(lián)組裝而成。即前面列出的串列式多級質(zhì)譜儀。 第二類利用了一個質(zhì)譜儀時間順序上的離子儲存能力，由具有存儲離子的分析器組成，如離子回旋共振儀（ICR）和離子阱質(zhì)譜儀。但不能進(jìn)行母離子掃描或中性丟失。,實(shí)驗室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型：,串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/M

15、S) ： 三重四極（QqQ） 離子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 q2 Q3,QqQ儀器可以方便的改變離子的動能，因此掃描速度快，體積小，常作為臺式進(jìn)入常規(guī)實(shí)驗室，缺點(diǎn)是質(zhì)量范圍及分辨率有限，不能進(jìn)行高分辨測定，只能做到單位質(zhì)量分辨。（通過高分辨能得到化合物的分子式）,在液質(zhì)聯(lián)機(jī)中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式輸送給分子離子，這個能量足以使得處在能量亞穩(wěn)態(tài)分子中的某些化學(xué)鍵斷裂并使一些特定的分子發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。,數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng),將接收來的電信號放大、處理并給出分析結(jié)果及控制質(zhì)譜儀個部分工作。 從幾伏低壓到幾千伏高壓。,LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化,1.接口的選

16、擇： ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)） APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。,2.正、負(fù)離子模式的選擇：,選擇的一般原則為： 正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。 負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化。樣品中含有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負(fù)離子模式。,3.流動相的選擇,常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲

17、酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。 LCMS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸銨10一5 mmol/l。 送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。,4.流量和色譜柱的選擇,不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lmlmin，建議使用200400ulmin APCI的最佳流速lmlmi

18、n，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。 為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。,5.輔助氣體流量和溫度的選擇,霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。 操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20 左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。 選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機(jī)溶劑比例高時可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的。,

19、樣品的預(yù)處理：,為什么要進(jìn)行樣品的預(yù)處理： 從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對分析結(jié)果的干擾。 要求獲得最佳的分析結(jié)果，從ESI電離的過程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競爭，不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。,樣品的預(yù)處理常用方法,a）超濾 b）溶劑萃取去鹽 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）凈化去鹽 e）色譜分離 反相色譜分離 親和技術(shù)分離 f）甲醇或乙腈沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化,化合物鑒別,全掃描方式（Q1掃描） 全掃描

20、數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認(rèn)一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。 子離子分析（ MS/MS ） 子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。 子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。,影響分子量測定的因素,1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形。 2）

21、氣流和溫度：當(dāng)水含量高及流量大時要相應(yīng)增加。 3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。 4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些 5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱 6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少 7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好 9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮,分子量測定中的誤判,溶劑中的雜質(zhì) 來自于塑料添加劑的峰 樣品容器不干凈，常見表面活性劑的峰 進(jìn)樣系統(tǒng)污染 樣品在源內(nèi)

22、碎裂，形成碎片離子,分子量測定失敗的原因,a）流動相不合適 b）不揮發(fā)性鹽的影響 c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多 d) 樣品濃度不夠 e）pH值不合適 f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂,各種掃描方式的原理解釋：,Q1 Full Scan (Start Stop)(Q1全掃描) Q1 always used as single MS analyzer Used primarily for ident. of precursor ion,SIM - Selected Ion Monitoring(選擇離子監(jiān)測),Used to optimize analyzer for specific ions SIM used for quantitative analyses Q1 SIM used to “optimize” precursor ion Maximize signal in preparation for MS/MS,