DNA第2代測(cè)序技術(shù)ppt課件

1、DNA第2代測(cè)序技術(shù)與遺傳學(xué)發(fā)展,1,學(xué)習(xí)交流PPT,一. DNA第2代測(cè)序技術(shù) 二. 遺傳學(xué)的發(fā)展 三.第2代測(cè)序技術(shù)對(duì)遺傳學(xué)發(fā)展的影響,2,學(xué)習(xí)交流PPT,1.1 什么是DNA第2代測(cè)序技術(shù),第2代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing）是對(duì)傳統(tǒng)Sanger法測(cè)序的一次革命性的改變，是一次可對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定的高通量的測(cè)序技術(shù)，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序(deep sequencing)。,一. DNA第2代測(cè)序技術(shù),3,學(xué)習(xí)交流PPT,1.2 為什么要發(fā)展第2代測(cè)序技術(shù),快速和

2、準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息對(duì)于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對(duì)于每個(gè)生物體來說，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)能夠真實(shí)地反映基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因而在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。,4,學(xué)習(xí)交流PPT,1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。 盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測(cè)序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測(cè)試，進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司的45

3、4技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了。,5,學(xué)習(xí)交流PPT,1.3 第2代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn),速度快 準(zhǔn)確度高 成本低 覆蓋度深 產(chǎn)出巨大,6,學(xué)習(xí)交流PPT,1.4 第2代測(cè)序技術(shù)的原理,第2代測(cè)序技術(shù)包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。 下面對(duì)三種第二代測(cè)序技術(shù)的原理和特點(diǎn)分別進(jìn)行具體介紹。,7,學(xué)習(xí)交流PPT,圖1. 454測(cè)序技術(shù)流程,8,學(xué)習(xí)交流PPT,454技術(shù)的主要缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物(homopolymer)的長(zhǎng)度。例如當(dāng)待測(cè)序列中出現(xiàn)Poly(A)

4、的情況下，測(cè)序反應(yīng)中會(huì)一次加上多個(gè)T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號(hào)的強(qiáng)度來推測(cè)，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是因?yàn)檫@個(gè)原因，454技術(shù)主要的錯(cuò)誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。 454技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于較長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。,9,學(xué)習(xí)交流PPT,圖2. Solexa測(cè)序技術(shù)流程,10,學(xué)習(xí)交流PPT,Solexa技術(shù)的讀取長(zhǎng)度可以達(dá)到275bp，相比454技術(shù)，其后續(xù)的序列拼接工作的計(jì)算量和難度均大大增加。 Solexa技術(shù)主要的錯(cuò)誤來源是核苷酸的替換，而不是插入或缺失，目前它的錯(cuò)誤率大約在1-1.5 %之間。 Solexa技術(shù)每個(gè)循環(huán)能獲得20.5-2

5、5 Gb的測(cè)序結(jié)果，耗時(shí)約9.5天。 Solexa技術(shù)在合成中每次只能添加一個(gè)dNTP，因此很好地解決了同聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問題。,11,學(xué)習(xí)交流PPT,圖3. SOLiD測(cè)序技術(shù)流程,12,學(xué)習(xí)交流PPT,SOLiD技術(shù)與Solexa技術(shù)類似，后續(xù)的序列拼接工作也比較復(fù)雜。 SOLiD技術(shù)每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為10-15 Gb，耗時(shí)約為6-7天。 SOLiD技術(shù)每個(gè)循環(huán)可以測(cè)兩個(gè)上樣玻片，讀取長(zhǎng)度可達(dá)250bp，而且由于采用兩堿基測(cè)序，該技術(shù)的準(zhǔn)確率能達(dá)到99.94 %以上。,13,學(xué)習(xí)交流PPT,1.5 第2代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用,高通量測(cè)序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實(shí)驗(yàn)步驟，避免了亞克隆過

6、程中引入的偏差。 依靠后期強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，對(duì)照一個(gè)參比基因組(reference genome)高通量測(cè)序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測(cè)序(re-sequence) 。,14,學(xué)習(xí)交流PPT,2007年Van Orsouw等人結(jié)合改進(jìn)的AFLP 技術(shù)和454 測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米基因組進(jìn)行了重測(cè)序，所發(fā)現(xiàn)的超過75%的SNP位點(diǎn)能夠用SNPWave技術(shù)驗(yàn)證，提供了一條對(duì)復(fù)雜基因組特別是含有高度重復(fù)序列的植物基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的技術(shù)路線。 2008年Hillier對(duì)線蟲CB4858 品系進(jìn)行Solexa重測(cè)序，尋找線蟲基因組中的SNP位點(diǎn)和單位點(diǎn)的缺失或擴(kuò)增。,15,學(xué)習(xí)交流PPT,200

7、8年Mortazavi等人對(duì)小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進(jìn)行了RNA 深度測(cè)序。分析測(cè)得的序列，有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報(bào)道過的RNA剪切形式、3端非翻譯區(qū)、變動(dòng)的啟動(dòng)子區(qū)域以及潛在的小RNA 前體。而這些信息無論使用芯片技術(shù)還是SAGE文庫測(cè)序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。,高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組mRNA表達(dá)譜，microRNA表達(dá)譜，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應(yīng)用。,16,學(xué)習(xí)交流PPT,高通量測(cè)序另一個(gè)被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測(cè)序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測(cè)小分子時(shí)遇到的技術(shù)

8、難題(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測(cè)序的長(zhǎng)度，使得數(shù)據(jù)“不浪費(fèi)”，同時(shí)測(cè)序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子RNA。在線蟲中獲得了40 萬個(gè)序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了18個(gè)新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA。,17,學(xué)習(xí)交流PPT,在DNA蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀深度測(cè)序(ChIP-seq)實(shí)驗(yàn)也展示了其非常大的潛力。染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA 直接進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比ref seq可以直接獲得蛋白與DNA結(jié)合的位點(diǎn)信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以檢測(cè)更小的結(jié)合區(qū)

9、段、未知的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。,18,學(xué)習(xí)交流PPT,1.6 第2代測(cè)序技術(shù)的前景,大多分析家都無法相信新一代測(cè)序技術(shù)能完全取代目前的芯片測(cè)序技術(shù)。 新一代測(cè)序儀推廣困難可能由其價(jià)格昂貴導(dǎo)致。 但是，基因芯片也有其自身的缺點(diǎn)，就在于它是一個(gè)“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測(cè)人們已知序列的特征(或有限的變異)。而高通量測(cè)序的強(qiáng)項(xiàng)， 就在于它是一個(gè)“開放系統(tǒng)”， 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。,19,學(xué)習(xí)交流PPT,新一代測(cè)序技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)芯片測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，最終還得依靠廣告和市場(chǎng)營(yíng)銷手段的推廣才能獲得大眾的認(rèn)可。 近期出現(xiàn)的Helicos公司的He

10、liscope單分子測(cè)序儀、PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)， 被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。 與前兩代技術(shù)相比，第三代測(cè)序技術(shù)最大的特點(diǎn)是單分子測(cè)序。,20,學(xué)習(xí)交流PPT,21,學(xué)習(xí)交流PPT,二. 遺傳學(xué)的發(fā)展,遺傳學(xué)（genetics）是研究生物遺傳與變異的科學(xué)；是研究基因的結(jié)構(gòu)、功能及其變異、傳遞和表達(dá)規(guī)律的學(xué)科。 新石器時(shí)代人類就已經(jīng)馴養(yǎng)動(dòng)物和栽培植物，而后人們逐漸學(xué)會(huì)了改良動(dòng)植物品種的方法。 改良品種的活動(dòng)從那時(shí)以后從未中斷。但是，直到18世紀(jì)下半葉和19世紀(jì)下半葉，才由拉馬克

11、和達(dá)爾文對(duì)生物界遺傳和變異進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。 真正系統(tǒng)研究生物的遺傳和變異是從孟德爾開始的。,22,學(xué)習(xí)交流PPT,孟德爾于1866年發(fā)表了論文植物雜交試驗(yàn)，首次提出分離和獨(dú)立分配兩個(gè)遺傳規(guī)律，并認(rèn)為性狀遺傳是受細(xì)胞里的遺傳因子控制的。 但是，孟德爾的這一重要理論當(dāng)時(shí)未能收到重視，直到1900年，狄弗利斯柴馬克和柯倫斯三人才同時(shí)發(fā)現(xiàn)。 1900年孟德爾遺傳規(guī)律的重新發(fā)現(xiàn)，被公認(rèn)為遺傳學(xué)建立和發(fā)展的一年，并于1906年將遺傳學(xué)作為一個(gè)學(xué)科的名稱。,23,學(xué)習(xí)交流PPT,大致是19101940年，這一時(shí)期通過對(duì)遺傳學(xué)規(guī)律和染色體行為的研究確立了遺傳的染色體學(xué)說。這一時(shí)期中雖然由美國遺傳學(xué)家馬勒和斯

12、塔德勒分別在動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)了X射線的誘變作用，可是對(duì)于基因突變機(jī)制的研究并沒有進(jìn)展。基因作用機(jī)制研究的重要成果則幾乎只限于動(dòng)植物色素的遺傳研究方面。,從1910年到現(xiàn)在，遺傳學(xué)的發(fā)展大致可以分為三個(gè)時(shí)期：細(xì)胞遺傳學(xué)時(shí)期、微生物遺傳學(xué)時(shí)期和分子遺傳學(xué)時(shí)期。,細(xì)胞遺傳學(xué)時(shí)期,24,學(xué)習(xí)交流PPT,大致是19401960年，在這一時(shí)期中，采用微生物作為材料研究基因的原初作用、精細(xì)結(jié)構(gòu)、化學(xué)本質(zhì)、突變機(jī)制以及細(xì)菌的基因重組、基因調(diào)控等，取得了已往在高等動(dòng)植物研究中難以取得的成果，從而豐富了遺傳學(xué)的基礎(chǔ)理論。,微生物遺傳學(xué)時(shí)期,25,學(xué)習(xí)交流PPT,這一時(shí)期從1963年沃森和克里克提出DNA的雙螺旋模型開

13、始，但是50年代只在DNA分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制方面取得了一些成就，而遺傳密碼、mRNA、tRNA、核糖體的功能等則幾乎都是60年代才得以初步闡明。 20世紀(jì)70年代初，建立了遺傳工程這一新的研究領(lǐng)域。遺傳工程是在細(xì)菌質(zhì)粒和噬苗體以及限制性內(nèi)切酶研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它不但可以應(yīng)用于工、農(nóng)、醫(yī)各個(gè)方面，而且還進(jìn)一步推進(jìn)分子遺傳學(xué)和其他遺傳學(xué)分支學(xué)科的研究。,分子遺傳學(xué)時(shí)期,26,學(xué)習(xí)交流PPT,20世紀(jì)90年代初美國率先實(shí)施的“人類基因組計(jì)劃”，旨在測(cè)定人類基因組全部約32億個(gè)核苷酸對(duì)的排列順序，構(gòu)建控制人類生長(zhǎng)發(fā)育的約3.5萬個(gè)基因的遺傳和物理圖譜，確定人類基因組編碼的遺傳信息。 21世紀(jì)，遺傳學(xué)的發(fā)展進(jìn)入“后基因組時(shí)代”。,27,學(xué)習(xí)交流PPT,三. 第2代測(cè)序技術(shù)對(duì)遺傳學(xué)發(fā)展的影響,DNA測(cè)序技術(shù)是遺傳學(xué)研究中發(fā)展起來的一個(gè)最基本的技術(shù)，它使得研究者可以確定DNA片段的核苷酸序列 。 測(cè)序技術(shù)可以運(yùn)用于腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病原學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、藥學(xué)等多學(xué)科。,28,學(xué)習(xí)交流PPT,昂貴的費(fèi)用是阻礙個(gè)體基因組測(cè)序普及的最大障礙，而隨著新的高通量測(cè)