DNA第2代測序技術ppt課件

1、DNA第2代測序技術與遺傳學發(fā)展,1,學習交流PPT,一. DNA第2代測序技術 二. 遺傳學的發(fā)展 三.第2代測序技術對遺傳學發(fā)展的影響,2,學習交流PPT,1.1 什么是DNA第2代測序技術,第2代測序技術（next-generation sequencing）是對傳統(tǒng)Sanger法測序的一次革命性的改變，是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的高通量的測序技術，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。,一. DNA第2代測序技術,3,學習交流PPT,1.2 為什么要發(fā)展第2代測序技術,快速和

2、準確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科學研究一直具有十分重要的意義。對于每個生物體來說，基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術能夠真實地反映基因組DNA上的遺傳信息，進而比較全面地揭示基因組的復雜性和多樣性，因而在生命科學研究中扮演了十分重要的角色。,4,學習交流PPT,1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技術的誕生。 盡管第一代測序技術已經幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經過不斷的開發(fā)和測試，進入21世紀后，以Roche公司的45

3、4技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術為標志的第二代測序技術誕生了。,5,學習交流PPT,1.3 第2代測序技術的特點,速度快 準確度高 成本低 覆蓋度深 產出巨大,6,學習交流PPT,1.4 第2代測序技術的原理,第2代測序技術包括Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術。 下面對三種第二代測序技術的原理和特點分別進行具體介紹。,7,學習交流PPT,圖1. 454測序技術流程,8,學習交流PPT,454技術的主要缺點是無法準確測量同聚物(homopolymer)的長度。例如當待測序列中出現Poly(A)

4、的情況下，測序反應中會一次加上多個T，而加入T的數目只能從熒光信號的強度來推測，有可能造成結果不準確。也正是因為這個原因，454技術主要的錯誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。 454技術最大的優(yōu)勢在于較長的讀取長度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準確。,9,學習交流PPT,圖2. Solexa測序技術流程,10,學習交流PPT,Solexa技術的讀取長度可以達到275bp，相比454技術，其后續(xù)的序列拼接工作的計算量和難度均大大增加。 Solexa技術主要的錯誤來源是核苷酸的替換，而不是插入或缺失，目前它的錯誤率大約在1-1.5 %之間。 Solexa技術每個循環(huán)能獲得20.5-2

5、5 Gb的測序結果，耗時約9.5天。 Solexa技術在合成中每次只能添加一個dNTP，因此很好地解決了同聚物長度的準確測量問題。,11,學習交流PPT,圖3. SOLiD測序技術流程,12,學習交流PPT,SOLiD技術與Solexa技術類似，后續(xù)的序列拼接工作也比較復雜。 SOLiD技術每個循環(huán)的數據產出量為10-15 Gb，耗時約為6-7天。 SOLiD技術每個循環(huán)可以測兩個上樣玻片，讀取長度可達250bp，而且由于采用兩堿基測序，該技術的準確率能達到99.94 %以上。,13,學習交流PPT,1.5 第2代測序技術的應用,高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構建這一實驗步驟，避免了亞克隆過

6、程中引入的偏差。 依靠后期強大的生物信息學分析能力，對照一個參比基因組(reference genome)高通量測序技術可以非常輕松完成基因組重測序(re-sequence) 。,14,學習交流PPT,2007年Van Orsouw等人結合改進的AFLP 技術和454 測序技術對玉米基因組進行了重測序，所發(fā)現的超過75%的SNP位點能夠用SNPWave技術驗證，提供了一條對復雜基因組特別是含有高度重復序列的植物基因組進行多態(tài)性分析的技術路線。 2008年Hillier對線蟲CB4858 品系進行Solexa重測序，尋找線蟲基因組中的SNP位點和單位點的缺失或擴增。,15,學習交流PPT,200

7、8年Mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進行了RNA 深度測序。分析測得的序列，有大于90%的數據顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數據分析展示的是從未被報道過的RNA剪切形式、3端非翻譯區(qū)、變動的啟動子區(qū)域以及潛在的小RNA 前體。而這些信息無論使用芯片技術還是SAGE文庫測序都是無法被發(fā)現的。,高通量測序技術在全基因組mRNA表達譜，microRNA表達譜，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應用。,16,學習交流PPT,高通量測序另一個被廣泛應用的領域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術在檢測小分子時遇到的技術

8、難題(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數據“不浪費”，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現新的小分子RNA。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經成功地找到了新的小分子RNA。在線蟲中獲得了40 萬個序列，通過分析發(fā)現了18個新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA。,17,學習交流PPT,在DNA蛋白質相互作用的研究上，染色質免疫沉淀深度測序(ChIP-seq)實驗也展示了其非常大的潛力。染色質免疫沉淀以后的DNA 直接進行測序，對比ref seq可以直接獲得蛋白與DNA結合的位點信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以檢測更小的結合區(qū)

9、段、未知的結合位點、結合位點內的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。,18,學習交流PPT,1.6 第2代測序技術的前景,大多分析家都無法相信新一代測序技術能完全取代目前的芯片測序技術。 新一代測序儀推廣困難可能由其價格昂貴導致。 但是，基因芯片也有其自身的缺點，就在于它是一個“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)。而高通量測序的強項， 就在于它是一個“開放系統(tǒng)”， 它的發(fā)現能力和尋找新的信息的能力，從本質上高于芯片技術。,19,學習交流PPT,新一代測序技術相對傳統(tǒng)芯片測序技術的優(yōu)勢，最終還得依靠廣告和市場營銷手段的推廣才能獲得大眾的認可。 近期出現的Helicos公司的He

10、liscope單分子測序儀、PacificBiosciences公司的SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子技術， 被認為是第三代測序技術。 與前兩代技術相比，第三代測序技術最大的特點是單分子測序。,20,學習交流PPT,21,學習交流PPT,二. 遺傳學的發(fā)展,遺傳學（genetics）是研究生物遺傳與變異的科學；是研究基因的結構、功能及其變異、傳遞和表達規(guī)律的學科。 新石器時代人類就已經馴養(yǎng)動物和栽培植物，而后人們逐漸學會了改良動植物品種的方法。 改良品種的活動從那時以后從未中斷。但是，直到18世紀下半葉和19世紀下半葉，才由拉馬克

11、和達爾文對生物界遺傳和變異進行了系統(tǒng)的研究。 真正系統(tǒng)研究生物的遺傳和變異是從孟德爾開始的。,22,學習交流PPT,孟德爾于1866年發(fā)表了論文植物雜交試驗，首次提出分離和獨立分配兩個遺傳規(guī)律，并認為性狀遺傳是受細胞里的遺傳因子控制的。 但是，孟德爾的這一重要理論當時未能收到重視，直到1900年，狄弗利斯柴馬克和柯倫斯三人才同時發(fā)現。 1900年孟德爾遺傳規(guī)律的重新發(fā)現，被公認為遺傳學建立和發(fā)展的一年，并于1906年將遺傳學作為一個學科的名稱。,23,學習交流PPT,大致是19101940年，這一時期通過對遺傳學規(guī)律和染色體行為的研究確立了遺傳的染色體學說。這一時期中雖然由美國遺傳學家馬勒和斯

12、塔德勒分別在動植物中發(fā)現了X射線的誘變作用，可是對于基因突變機制的研究并沒有進展。基因作用機制研究的重要成果則幾乎只限于動植物色素的遺傳研究方面。,從1910年到現在，遺傳學的發(fā)展大致可以分為三個時期：細胞遺傳學時期、微生物遺傳學時期和分子遺傳學時期。,細胞遺傳學時期,24,學習交流PPT,大致是19401960年，在這一時期中，采用微生物作為材料研究基因的原初作用、精細結構、化學本質、突變機制以及細菌的基因重組、基因調控等，取得了已往在高等動植物研究中難以取得的成果，從而豐富了遺傳學的基礎理論。,微生物遺傳學時期,25,學習交流PPT,這一時期從1963年沃森和克里克提出DNA的雙螺旋模型開

13、始，但是50年代只在DNA分子結構和復制方面取得了一些成就，而遺傳密碼、mRNA、tRNA、核糖體的功能等則幾乎都是60年代才得以初步闡明。 20世紀70年代初，建立了遺傳工程這一新的研究領域。遺傳工程是在細菌質粒和噬苗體以及限制性內切酶研究的基礎上發(fā)展起來的，它不但可以應用于工、農、醫(yī)各個方面，而且還進一步推進分子遺傳學和其他遺傳學分支學科的研究。,分子遺傳學時期,26,學習交流PPT,20世紀90年代初美國率先實施的“人類基因組計劃”，旨在測定人類基因組全部約32億個核苷酸對的排列順序，構建控制人類生長發(fā)育的約3.5萬個基因的遺傳和物理圖譜，確定人類基因組編碼的遺傳信息。 21世紀，遺傳學的發(fā)展進入“后基因組時代”。,27,學習交流PPT,三. 第2代測序技術對遺傳學發(fā)展的影響,DNA測序技術是遺傳學研究中發(fā)展起來的一個最基本的技術，它使得研究者可以確定DNA片段的核苷酸序列 。 測序技術可以運用于腫瘤學、遺傳學、免疫學、病原學、微生物學、寄生蟲學、藥學等多學科。,28,學習交流PPT,昂貴的費用是阻礙個體基因組測序普及的最大障礙，而隨著新的高通量測