DNA第2代測序技術(shù)ppt課件

1、DNA第2代測序技術(shù)與遺傳學(xué)發(fā)展,1,學(xué)習(xí)交流PPT,一. DNA第2代測序技術(shù) 二. 遺傳學(xué)的發(fā)展 三.第2代測序技術(shù)對遺傳學(xué)發(fā)展的影響,2,學(xué)習(xí)交流PPT,1.1 什么是DNA第2代測序技術(shù),第2代測序技術(shù)（next-generation sequencing）是對傳統(tǒng)Sanger法測序的一次革命性的改變，是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定的高通量的測序技術(shù)，同時(shí)高通量測序使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。,一. DNA第2代測序技術(shù),3,學(xué)習(xí)交流PPT,1.2 為什么要發(fā)展第2代測序技術(shù),快速和

2、準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對于每個(gè)生物體來說，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測序技術(shù)能夠真實(shí)地反映基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因而在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。,4,學(xué)習(xí)交流PPT,1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的誕生。 盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司的45

3、4技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測序技術(shù)誕生了。,5,學(xué)習(xí)交流PPT,1.3 第2代測序技術(shù)的特點(diǎn),速度快 準(zhǔn)確度高 成本低 覆蓋度深 產(chǎn)出巨大,6,學(xué)習(xí)交流PPT,1.4 第2代測序技術(shù)的原理,第2代測序技術(shù)包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。 下面對三種第二代測序技術(shù)的原理和特點(diǎn)分別進(jìn)行具體介紹。,7,學(xué)習(xí)交流PPT,圖1. 454測序技術(shù)流程,8,學(xué)習(xí)交流PPT,454技術(shù)的主要缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測量同聚物(homopolymer)的長度。例如當(dāng)待測序列中出現(xiàn)Poly(A)

4、的情況下，測序反應(yīng)中會(huì)一次加上多個(gè)T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號(hào)的強(qiáng)度來推測，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是因?yàn)檫@個(gè)原因，454技術(shù)主要的錯(cuò)誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。 454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于較長的讀取長度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。,9,學(xué)習(xí)交流PPT,圖2. Solexa測序技術(shù)流程,10,學(xué)習(xí)交流PPT,Solexa技術(shù)的讀取長度可以達(dá)到275bp，相比454技術(shù)，其后續(xù)的序列拼接工作的計(jì)算量和難度均大大增加。 Solexa技術(shù)主要的錯(cuò)誤來源是核苷酸的替換，而不是插入或缺失，目前它的錯(cuò)誤率大約在1-1.5 %之間。 Solexa技術(shù)每個(gè)循環(huán)能獲得20.5-2

5、5 Gb的測序結(jié)果，耗時(shí)約9.5天。 Solexa技術(shù)在合成中每次只能添加一個(gè)dNTP，因此很好地解決了同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題。,11,學(xué)習(xí)交流PPT,圖3. SOLiD測序技術(shù)流程,12,學(xué)習(xí)交流PPT,SOLiD技術(shù)與Solexa技術(shù)類似，后續(xù)的序列拼接工作也比較復(fù)雜。 SOLiD技術(shù)每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為10-15 Gb，耗時(shí)約為6-7天。 SOLiD技術(shù)每個(gè)循環(huán)可以測兩個(gè)上樣玻片，讀取長度可達(dá)250bp，而且由于采用兩堿基測序，該技術(shù)的準(zhǔn)確率能達(dá)到99.94 %以上。,13,學(xué)習(xí)交流PPT,1.5 第2代測序技術(shù)的應(yīng)用,高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實(shí)驗(yàn)步驟，避免了亞克隆過

6、程中引入的偏差。 依靠后期強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，對照一個(gè)參比基因組(reference genome)高通量測序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測序(re-sequence) 。,14,學(xué)習(xí)交流PPT,2007年Van Orsouw等人結(jié)合改進(jìn)的AFLP 技術(shù)和454 測序技術(shù)對玉米基因組進(jìn)行了重測序，所發(fā)現(xiàn)的超過75%的SNP位點(diǎn)能夠用SNPWave技術(shù)驗(yàn)證，提供了一條對復(fù)雜基因組特別是含有高度重復(fù)序列的植物基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的技術(shù)路線。 2008年Hillier對線蟲CB4858 品系進(jìn)行Solexa重測序，尋找線蟲基因組中的SNP位點(diǎn)和單位點(diǎn)的缺失或擴(kuò)增。,15,學(xué)習(xí)交流PPT,200

7、8年Mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進(jìn)行了RNA 深度測序。分析測得的序列，有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報(bào)道過的RNA剪切形式、3端非翻譯區(qū)、變動(dòng)的啟動(dòng)子區(qū)域以及潛在的小RNA 前體。而這些信息無論使用芯片技術(shù)還是SAGE文庫測序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。,高通量測序技術(shù)在全基因組mRNA表達(dá)譜，microRNA表達(dá)譜，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應(yīng)用。,16,學(xué)習(xí)交流PPT,高通量測序另一個(gè)被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測小分子時(shí)遇到的技術(shù)

8、難題(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據(jù)“不浪費(fèi)”，同時(shí)測序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子RNA。在線蟲中獲得了40 萬個(gè)序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了18個(gè)新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA。,17,學(xué)習(xí)交流PPT,在DNA蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀深度測序(ChIP-seq)實(shí)驗(yàn)也展示了其非常大的潛力。染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA 直接進(jìn)行測序，對比ref seq可以直接獲得蛋白與DNA結(jié)合的位點(diǎn)信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以檢測更小的結(jié)合區(qū)

9、段、未知的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。,18,學(xué)習(xí)交流PPT,1.6 第2代測序技術(shù)的前景,大多分析家都無法相信新一代測序技術(shù)能完全取代目前的芯片測序技術(shù)。 新一代測序儀推廣困難可能由其價(jià)格昂貴導(dǎo)致。 但是，基因芯片也有其自身的缺點(diǎn)，就在于它是一個(gè)“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)。而高通量測序的強(qiáng)項(xiàng)， 就在于它是一個(gè)“開放系統(tǒng)”， 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。,19,學(xué)習(xí)交流PPT,新一代測序技術(shù)相對傳統(tǒng)芯片測序技術(shù)的優(yōu)勢，最終還得依靠廣告和市場營銷手段的推廣才能獲得大眾的認(rèn)可。 近期出現(xiàn)的Helicos公司的He

10、liscope單分子測序儀、PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)， 被認(rèn)為是第三代測序技術(shù)。 與前兩代技術(shù)相比，第三代測序技術(shù)最大的特點(diǎn)是單分子測序。,20,學(xué)習(xí)交流PPT,21,學(xué)習(xí)交流PPT,二. 遺傳學(xué)的發(fā)展,遺傳學(xué)（genetics）是研究生物遺傳與變異的科學(xué)；是研究基因的結(jié)構(gòu)、功能及其變異、傳遞和表達(dá)規(guī)律的學(xué)科。 新石器時(shí)代人類就已經(jīng)馴養(yǎng)動(dòng)物和栽培植物，而后人們逐漸學(xué)會(huì)了改良動(dòng)植物品種的方法。 改良品種的活動(dòng)從那時(shí)以后從未中斷。但是，直到18世紀(jì)下半葉和19世紀(jì)下半葉，才由拉馬克

11、和達(dá)爾文對生物界遺傳和變異進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。 真正系統(tǒng)研究生物的遺傳和變異是從孟德爾開始的。,22,學(xué)習(xí)交流PPT,孟德爾于1866年發(fā)表了論文植物雜交試驗(yàn)，首次提出分離和獨(dú)立分配兩個(gè)遺傳規(guī)律，并認(rèn)為性狀遺傳是受細(xì)胞里的遺傳因子控制的。 但是，孟德爾的這一重要理論當(dāng)時(shí)未能收到重視，直到1900年，狄弗利斯柴馬克和柯倫斯三人才同時(shí)發(fā)現(xiàn)。 1900年孟德爾遺傳規(guī)律的重新發(fā)現(xiàn)，被公認(rèn)為遺傳學(xué)建立和發(fā)展的一年，并于1906年將遺傳學(xué)作為一個(gè)學(xué)科的名稱。,23,學(xué)習(xí)交流PPT,大致是19101940年，這一時(shí)期通過對遺傳學(xué)規(guī)律和染色體行為的研究確立了遺傳的染色體學(xué)說。這一時(shí)期中雖然由美國遺傳學(xué)家馬勒和斯

12、塔德勒分別在動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)了X射線的誘變作用，可是對于基因突變機(jī)制的研究并沒有進(jìn)展?；蜃饔脵C(jī)制研究的重要成果則幾乎只限于動(dòng)植物色素的遺傳研究方面。,從1910年到現(xiàn)在，遺傳學(xué)的發(fā)展大致可以分為三個(gè)時(shí)期：細(xì)胞遺傳學(xué)時(shí)期、微生物遺傳學(xué)時(shí)期和分子遺傳學(xué)時(shí)期。,細(xì)胞遺傳學(xué)時(shí)期,24,學(xué)習(xí)交流PPT,大致是19401960年，在這一時(shí)期中，采用微生物作為材料研究基因的原初作用、精細(xì)結(jié)構(gòu)、化學(xué)本質(zhì)、突變機(jī)制以及細(xì)菌的基因重組、基因調(diào)控等，取得了已往在高等動(dòng)植物研究中難以取得的成果，從而豐富了遺傳學(xué)的基礎(chǔ)理論。,微生物遺傳學(xué)時(shí)期,25,學(xué)習(xí)交流PPT,這一時(shí)期從1963年沃森和克里克提出DNA的雙螺旋模型開

13、始，但是50年代只在DNA分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制方面取得了一些成就，而遺傳密碼、mRNA、tRNA、核糖體的功能等則幾乎都是60年代才得以初步闡明。 20世紀(jì)70年代初，建立了遺傳工程這一新的研究領(lǐng)域。遺傳工程是在細(xì)菌質(zhì)粒和噬苗體以及限制性內(nèi)切酶研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它不但可以應(yīng)用于工、農(nóng)、醫(yī)各個(gè)方面，而且還進(jìn)一步推進(jìn)分子遺傳學(xué)和其他遺傳學(xué)分支學(xué)科的研究。,分子遺傳學(xué)時(shí)期,26,學(xué)習(xí)交流PPT,20世紀(jì)90年代初美國率先實(shí)施的“人類基因組計(jì)劃”，旨在測定人類基因組全部約32億個(gè)核苷酸對的排列順序，構(gòu)建控制人類生長發(fā)育的約3.5萬個(gè)基因的遺傳和物理圖譜，確定人類基因組編碼的遺傳信息。 21世紀(jì)，遺傳學(xué)的發(fā)展進(jìn)入“后基因組時(shí)代”。,27,學(xué)習(xí)交流PPT,三. 第2代測序技術(shù)對遺傳學(xué)發(fā)展的影響,DNA測序技術(shù)是遺傳學(xué)研究中發(fā)展起來的一個(gè)最基本的技術(shù)，它使得研究者可以確定DNA片段的核苷酸序列 。 測序技術(shù)可以運(yùn)用于腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病原學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、藥學(xué)等多學(xué)科。,28,學(xué)習(xí)交流PPT,昂貴的費(fèi)用是阻礙個(gè)體基因組測序普及的最大障礙，而隨著新的高通量測