《轉(zhuǎn)基因和克隆動物》PPT課件.ppt

1、轉(zhuǎn)基因動物和克隆動物,一、轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物：指染色體基因組中整合有外源基因并能遺傳給后代的一類動物。整合到動物染色體基因組的外源基因被稱為轉(zhuǎn)基因。,當制備轉(zhuǎn)基因動物時外源基因可能只整合到動物的部分組織細胞的基因組，也可能整合進動物所有組織細胞的基因組中。如果動物所有的細胞均整合有外源基因，則具有將外源基因遺傳給子代的能力，通常把這類動物稱為轉(zhuǎn)基因動物. 如果只有部分組織細胞的基因組中整合有外源基因的動物，把這類動物稱為嵌合體動物（Chimeric animal）,只有當外源基因整合入的細胞恰為生殖細胞時，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代，否則，外源基因?qū)⒉荒軅鹘o子代。 一般用胚胎干細胞法

2、、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法制備的第1代轉(zhuǎn)基因動物均為嵌合體動物，而顯微注射法得到的第1代轉(zhuǎn)基因動物中，也約有20為嵌合體動物。,二、轉(zhuǎn)基因動物研究進展, 轉(zhuǎn)基因動物研究的簡要回顧 1977年，Gordon首先用微注射的方法將外源mRNA和DNA注射到非洲爪贍胚胎，發(fā)現(xiàn)被注入的核酸完全有功能。1980年Brinster等利用小鼠胚胎作了類似的研究，表明外源DNA能夠在胚胎細胞轉(zhuǎn)錄表達。這些工作奠定了生產(chǎn)可以“獲得新功能”的轉(zhuǎn)基因動物的科學思想和方法。,從1980年底至1981年，有6個研究組相繼報道成功地獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。Palmiter將5調(diào)控區(qū)缺失后的大鼠生長激素基因與小鼠金屬硫蛋白1基因啟動子相連

3、接，然后將融合基因注入受精小鼠的雄原核，生出21只小鼠，其中7只為轉(zhuǎn)基因陽性鼠。在陽性鼠中，2號鼠在出生后74天時，體重達到同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠平均體重的1.87倍，這便是著名的“超級小鼠”.,1985年Hammer等利用該方法成功地制作了轉(zhuǎn)基因兔、綿羊和豬。上述三起研究被認為是動物轉(zhuǎn)基因研究歷程上的里程碑. 轉(zhuǎn)基因動物研究與開發(fā)是整個生命科學中近年來發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域，1997年，僅各種不同類型的轉(zhuǎn)基因（transgenic）小鼠就達到了804種.,1988年4月12日美國專利局批準了第一個轉(zhuǎn)基因動物“原癌小鼠”(oncomouse)專利，稍后還獲得了歐洲專利局批準，打破了“動物生命不允許專利”

4、的鐵律。,1998年，美國和歐洲專利局共批準了42種轉(zhuǎn)基因動物專利，登記注冊了88種專利申請。轉(zhuǎn)基因動物研究正在全世界范圍內(nèi)形成一個前所未有的高潮。并將成為21世紀生物技術(shù)領(lǐng)域的支柱性產(chǎn)業(yè)。毫無疑問，動物轉(zhuǎn)基因正在改變農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生物材料，甚至是整個生命科學的研究與發(fā)展面貌。,2009年2月15日 . 美國食品和藥物管理局剛批準首個轉(zhuǎn)基因動物表達的抗血栓藥物 ATryn，人類終于有了第一個轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥物上市用于臨床。,我國的轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，從80年代初期開始了轉(zhuǎn)基因動物的研究。中國科學院發(fā)育所率先成功地將人-珠蛋白基因、大腸桿菌galk和 gpt基因、牛及人生長激素等基因，分別注入小

5、鼠受精卵，獲得了多種轉(zhuǎn)基因小鼠。,中國科學院水生所在國際上首先開展了轉(zhuǎn)基因魚的研究，并最早獲得了轉(zhuǎn)基因鯽魚個體，轉(zhuǎn)基因魚是目前國內(nèi)獲得最為成功的一種轉(zhuǎn)基因動物。,我國較大規(guī)模地進行轉(zhuǎn)基因動物的研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)是由我國“863計劃資助，也是“863”計劃最早實施的高技術(shù)項目之一。經(jīng)過十幾年的努力工作，取得了許多十分顯著的成績 先后獲得了生長速度快、瘦肉率高、對某些病毒有一定抗性的轉(zhuǎn)基因豬，在乳腺組織中能夠表達人藥用蛋白凝血因子IX、人生長激素、人紅細胞生成素等的轉(zhuǎn)基因羊。最近，還成功地獲得了轉(zhuǎn)基因牛。 1997年，“動物乳腺生物反應(yīng)器”的研究與開發(fā)列為“863”計劃的重大項目，表明一個新的轉(zhuǎn)基因

6、動物研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)高潮已經(jīng)在我國形成。,通過將純化的DNA分子導入動物種系生殖細胞基因組，從而實現(xiàn)對動物基因組的遺傳修飾并使其穩(wěn)定傳代，常用方法： 顯微注射法； 胚胎干細胞法； 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法,轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理,顯微注射法,同步獲得供體雌鼠（超排的）和受體母鼠（前者是通過注射雌激素的雌鼠與正常雄鼠交配而得；后著是通過與接扎雄鼠交配產(chǎn)生） 供體鼠注射人絨毛促性腺激素（HCG）32h后，采集受精卵，此時受精卵有清晰的原核。 用顯微注射法將純化的外源基因片段導入受精卵的雄原核內(nèi),將微注射后經(jīng)鑒定為存活的受精卵移植到同步交配的假孕母鼠的輸卵管（或子宮）內(nèi)。其中一部分移植卵能夠繼續(xù)生長發(fā)育成個體 鑒定

7、子代鼠中外源基因的整合和表達。 轉(zhuǎn)基因動物品系的建立。,優(yōu) 點 能將外源基因?qū)雱游锷臣毎?，從而實現(xiàn)對整個動物機體的基因修飾； 可以在機體整體水平研究基因表達所導致的生物學效應(yīng) 研究周期短； 缺 點 基因整合位點的隨機性； 基因表達的位置效應(yīng)；,胚胎干細胞法,將外源基因直接導入胚胎干細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后，通過顯微操作將其注射到囊腔中，在移植入受體的子宮內(nèi)，使其發(fā)育為嵌合體的轉(zhuǎn)基因動物。,胚胎干細胞（ES）是指從囊胚期的內(nèi)細胞團中分離出來的胚胎細胞，能在體外培養(yǎng)，具有發(fā)育全能性的細胞 ES細胞在發(fā)育上類似于早期胚胎的內(nèi)細胞團細胞，當被注入囊胚腔后可以參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織嵌合體的形成。

8、 ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點，是研究哺乳動物個體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機制的理想模型。,選擇合適的載體，將Cre重組酶的 編碼基因與其重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒 將重組質(zhì)粒其轉(zhuǎn)人培養(yǎng)的小鼠胚胎 干細胞中。 體外篩選穩(wěn)定整合外源基因的胚胎 干細胞。篩選出的胚胎干細胞被重 新注射到小鼠囊胚中，并植入到假 孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育為 一個完整的胚胎。 產(chǎn)出的嵌合體小鼠通過雜交，獲得 穩(wěn)定整合Cre重組酶的純合體轉(zhuǎn)基因小鼠。,胚胎干細胞的囊胚注射法構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因動物,本方法的優(yōu)點是：可用多種方法將外源基因?qū)隕S細胞，其細胞的鑒定和篩選比較方便?？深A先在細胞水平

9、上檢定外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性等，故轉(zhuǎn)基因動物外源基因整合率的可控制程度高于微注射法。ES細胞注入囊胚以及囊胚移植到子宮，在操作上比較簡便。 不足之處在于：建立ES細胞系本身就是一種高難技術(shù)，其培養(yǎng)條件至今無突破性進展。ES細胞的保存和維持也不容易。所得個體為嵌合性，如發(fā)生性嵌合，將導致生殖機能紊亂和不育。所需時間較長。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法,逆轉(zhuǎn)錄病毒具有侵入宿主細胞并整合于細胞染色體DNA的能力。將插入有外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA，通過輔助細胞包裝成高感染滴度的病毒顆粒，再感染桑椹期的胚胎細胞，隨后將胚胎導入子宮，可發(fā)育成攜帶外源基因的子代動物。原則上載體中可插

10、入各種基因組DNA和cDNA。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容納量在10kb以下，不能插入較大的外源基因。,該方法的優(yōu)點是：感染率高，且胚胎存活率高。病毒DNA隨機單拷貝整合。宿主范圍廣。 不足之處為：整合位點是隨機的，其整合率不高。由于病毒感染過程是在多次卵裂之后外源基因很難整合于所有胚胎細胞中，故多數(shù)子代動物是嵌合體。重組的反轉(zhuǎn)錄病毒不夠穩(wěn)定，外源基因易發(fā)生重排或丟失。病毒載體的容量不大。病毒DNA序列可能會干擾外源基因的表達。,轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展方向 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高或改良動物的生產(chǎn)性能，為人類提供更多更好的優(yōu)良畜牧產(chǎn)品； 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行生物制藥，生產(chǎn)人類所需的治療有關(guān)疑難病癥的特效藥物； 利用轉(zhuǎn)

11、基因動物還可以進行動物的遺傳改造，為人類提供大量可供移植用的器官； 最近的研究結(jié)果顯示，利用轉(zhuǎn)基因動物還可生產(chǎn)能生物降解、具有特殊強度的生物材料。,發(fā)展方向 l. 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物建立人類疾病的實驗動物模型，探討 疾病發(fā)生機理、治療方法和新藥篩選技術(shù)。 2. 進行生物反應(yīng)器制藥，治療人類的疑難病癥。 3. 人類器官移植的器官供體，克服免疫排斥。 4. 應(yīng)用于國防和生物材料，提高國家綜合國力。 5. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動物克隆技術(shù)完全結(jié)合，融為一體。,二、克隆動物,“克隆”（clone）是指一個遺傳單位或一個生命單位，通過無性繁殖方式，產(chǎn)生生物學上完全相同的遺傳單位或生命單位。動物克隆是一種通過核移植過

12、程進行動物無性繁殖的技術(shù)。,一個細菌經(jīng)過20分鐘左右就可一分為二；一根葡萄枝切 成十段就可能變成十株葡萄；仙人掌切成幾塊，每塊落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐莖，一年內(nèi)就能長出數(shù)百株草莓苗凡此種種，都是生物靠自身的一分為二或自身的一小部分的擴大來繁衍后代，這就是無性繁殖，無性繁殖的英文名稱叫“Clone”，譯音為“克隆”。,克隆動物：即動物的無性繁殖，主要借助于核移植技術(shù)，將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)過精子穿透等有性過程即被激活，分裂并發(fā)育成個體，使得核供體的基因得到完全復制。,英國PPL公司已培育出羊奶中含有治療肺氣腫的a-1抗胰蛋白酶的母羊。這種羊奶的售價是6千

13、美元一升。一只母羊就好比一座制藥廠，用什么辦法能最有效、最方便地使這種羊擴大繁殖呢？最好的辦法就是“克隆”。同樣，荷蘭PHP公司培育出能分泌人乳鐵蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生產(chǎn)血清白蛋白的羊，這些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案當然還是“克隆”。,理論基礎(chǔ),動物體細胞的全息性：幾乎所有的有核體細胞含有與受精卵相同的一整套遺傳物質(zhì) 卵母細胞（尤其M卵母細胞）具備對細胞核具備重編程的能力（reprogramming) 供核細胞與受核細胞之間的細胞周期的協(xié)調(diào)性是供核能被有效重編程或正常發(fā)育的重要條件,1997年2月，位于英國愛丁堡的Roslin研究所獲得了由成年哺乳動物體細胞克隆成的活羊羔

14、（Dolly）。開創(chuàng)了哺乳動物體細胞克隆的新紀元。 Dolly是采用乳腺細胞經(jīng)過“饑餓”培養(yǎng)，與去核的卵細胞進行電融合，促使融合細胞中遺傳物質(zhì)“重排”，然后逐步發(fā)育成胚胎。,1998年美國夏威夷大學采用小鼠卵丘細胞克隆出27只小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多利”以后的第二批哺乳動物體細胞核移植后代。 2000年6月，中國西北農(nóng)林科技大學利用成年山羊體細胞克隆出兩只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系統(tǒng)發(fā)育不良而早夭。據(jù)介紹，所采用的克隆技術(shù)為該研究組自己研究所得，與克隆“多利”的技術(shù)完全不同，這表明我國科學家也掌握了體細胞克隆的尖端技術(shù)。,克隆動物的技術(shù)路線,主要包括供核的分離、

15、受體細胞的去核、核卵重組、重組胚的融合、核移植胚的培養(yǎng)與移植。,克隆動物的研究價值和應(yīng)用前景,克服動物種間雜交障礙，創(chuàng)造出新的物種，培育良種 快速繁殖擴群 加快珍稀動物繁殖，搶救瀕危動物 為了解細胞發(fā)育的潛能性，細胞核與細胞質(zhì)之間相互關(guān)系提供研究工具 為研究胚胎發(fā)生及其調(diào)控提供了新視角,克隆動物存在的問題,作為一個新興的技術(shù)在實踐中，克隆動物的成功率還很低，維爾穆特研究組在培育“多利“的實驗中，融合了277枚移植核的卵細胞，僅獲得了“多利”這一只成活羔羊，成功率只有0.36，同時進行的胎兒成纖維細胞和胚胎細胞的克隆實驗的成功率也分別只有1.7和1.1，即使是使用“檀香山”技術(shù)，以分化程度較低的

16、卵丘細胞為核供體，其成功率也只有百分之幾。 此外，出生的部分個體表現(xiàn)出生理或免疫缺限。 克隆技術(shù)對倫理道德的沖擊。,多能性細胞研究及其在再生醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用進展,周琪，1970年4月出生，博士，研究員，博士生導師；中國科學院動物研究所所長助理，計劃生育生殖生物學國家重點實驗室副主任，干細胞與再生醫(yī)學研究中心主任，生殖工程研究組組長。,主要從事體細胞重編程機制、干細胞及再生醫(yī)學相關(guān)的研究工作?，F(xiàn)已建立多種克隆動物模型（兔、小鼠、牛、大鼠等多種動物），在國際上率先證明了小鼠克隆的可重復性；首次獲得體細胞克隆大鼠，研究成果發(fā)表在 Science, Development, Developmental Biology 等刊物, 并得到了Nature、Sci