藥物分析--定量分析2.ppt

1、第二節(jié) 定量分析方法特點(diǎn)（一）容量分析法的特點(diǎn) 容量分析法是將已知濃度的滴定液由滴定管滴加到待測(cè)藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測(cè)藥物按化學(xué)計(jì)量反應(yīng)完全為止，然后根據(jù)滴定液的濃度和消耗的體積，就可計(jì)算出被測(cè)藥物的含量。,滴定終點(diǎn)與等當(dāng)點(diǎn)不符-滴定誤差，需要選擇合適的指示劑指示終點(diǎn)。 通常用于測(cè)定高含量或中含量組分，即被測(cè)組分的含量在1%以上。容量分析法比較準(zhǔn)確，一般情況下相對(duì)誤差可達(dá)0.2%以下。 容量分析法操作簡(jiǎn)便、快速、比較準(zhǔn)確，儀器普通易得。,（二）容量分析法的計(jì)算問題1.滴定度是每1ml某摩爾濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y(cè)藥物的重量。中國(guó)藥典用毫克（mg）表示。2.滴定度(T)的計(jì)算 在容量

2、分析中，被測(cè)藥物（B)與滴定液(A)之間都按一定的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)的，反應(yīng)可表示為：,aAbB cCdD 滴定度（T）可按下式計(jì)算： （mg/ml）式中M對(duì)為滴定液的摩爾濃度，b為被測(cè)藥物的摩爾數(shù)，a為滴定液的摩爾數(shù)，B為被測(cè)藥物的毫摩爾質(zhì)量（分子量）。,3.百分含量計(jì)算 在測(cè)定藥物含量時(shí)，常用直接滴定法和回滴定法，其計(jì)算方法如下。（1)直接滴定法：此法是用滴定液直接滴定，以求得被測(cè)藥物的含量。含量=,藥典收載的容量分析法都給出了滴定度值，根據(jù)供試品取量（W）、消耗滴定液的體積（V)和滴定度（T），即可計(jì)算出被測(cè)藥物的百分含量。,在實(shí)際工作中，所配制的滴定液的摩爾濃度與藥典中規(guī)定的摩爾濃度不一定

3、恰好符合，此時(shí)就不能直接應(yīng)用藥典上所給出的滴定度（T），需乘以滴定液濃度校正因數(shù)（F）即可換算成實(shí)際的滴定度（T），即 T=T F,式中F=,含量,（2)回滴定法（剩余滴定法）：此法是先加入定、過量的滴定液A，使其與被測(cè)藥物反應(yīng)，待此反應(yīng)進(jìn)行完全后，再用另一滴定液B來回滴反應(yīng)中剩余的滴定液A。,1）無(wú)空白實(shí)驗(yàn) 含量%=2）空白實(shí)驗(yàn) 含量%=,二、光譜分析法 當(dāng)物質(zhì)與輻射能相互作用時(shí)，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生能級(jí)躍遷。記錄由能級(jí)躍遷所產(chǎn)生的輻射能隨波長(zhǎng)的變化所得的圖譜稱為光譜，利用物質(zhì)的光譜進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法稱為光譜分析法。 紫外一可見分光光度法、熒光分析法、原子吸收分光光度法和紅外分光光度法等

4、。,（一）紫外-可見分光光度法1.特點(diǎn)紫外-可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長(zhǎng)為200nm - 760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的光譜分析方法。主要特點(diǎn)如下： 1）靈敏度高，可達(dá)10 -4g/ml一10 -7g/ml 2）準(zhǔn)確度高，相對(duì)誤差為2%一5。,3）儀器價(jià)格較低廉，操作簡(jiǎn)單，易于普及。4）應(yīng)用廣泛。,2.朗伯一比耳定律： A=E l C 式中A一吸收度 l一液層厚度；C一溶液濃度；E一吸收系數(shù)，即單位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸收度。 有兩種表示方式：摩爾吸收系數(shù)：指在一定波長(zhǎng)下，溶液濃度為1 mol/L，厚度為1cm時(shí)的吸收度，用表示。百分吸收系數(shù)：指在一定波長(zhǎng)下，溶液濃度

5、為1%（W/V)，厚度為lcm時(shí)的吸收度，用 表示。兩者之間的關(guān)系為,= 或,其中M是吸光物質(zhì)的分子量（即摩爾質(zhì)量）。多用于研究分子結(jié)構(gòu)， 多用于定量測(cè)定。 值的大小反映了物質(zhì)對(duì)某一波長(zhǎng)光的吸收能力，也反映測(cè)定反應(yīng)的靈敏度，摩爾吸收系數(shù)一般不超過105數(shù)量級(jí)。 吸收系數(shù)或 都不能直接測(cè)得，而必須采用適宜的已知準(zhǔn)確濃度的稀溶液測(cè)得吸收度A后計(jì)算求得。,3.儀器校正和檢定 4.對(duì)溶劑的要求 測(cè)定供試品之前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求。5.測(cè)定法 測(cè)定時(shí)，須作波長(zhǎng)校正。并作空白吸收。 用于含量測(cè)定的方法一般有以下幾種：,（1）對(duì)照品比較法：按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品

6、溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分標(biāo)示量的10010%，所用溶劑也應(yīng)完全一致，在規(guī)定的波長(zhǎng)測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸收度后，按下式計(jì)算供試品中被測(cè)溶液的濃度：,式中Cx為供試品溶液的濃度,Ax為供試品溶液的吸收度，Cr為對(duì)照品溶液的濃度,Ar為對(duì)照品溶液的吸收度，D為稀釋倍數(shù)，W為供試品取樣量。,（2）吸收系數(shù)法：按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。含量=,用本法測(cè)定時(shí)，應(yīng)注意儀器的校正和檢定。,（3）計(jì)算分光光度法： 當(dāng)吸收度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測(cè)定時(shí)，影響精度的因素較多

7、，故對(duì)照品和供試品測(cè)試條件應(yīng)盡可能一致。 若測(cè)定時(shí)不用對(duì)照品，如維生素A測(cè)定法，則應(yīng)在測(cè)定時(shí)對(duì)儀器作仔細(xì)地校正和檢定。,（二）熒光分析法1. 某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光。當(dāng)激發(fā)光停止照射后，熒光隨之消失。 同一種分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，用同一波長(zhǎng)的激發(fā)光照射，可以發(fā)射相同波長(zhǎng)的熒光。 當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長(zhǎng)、所用溶劑及溫度等條件固定時(shí)，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度（也叫發(fā)射光強(qiáng)度）與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，可以用作定量分析。,本法特點(diǎn)為： （1）靈敏度高，熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法為高，其靈敏度可達(dá)10-10g/ml一10-12g/ml（2）熒光

8、分析法應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行（3）空白試驗(yàn),（4）對(duì)易被光分解的樣品，為使儀器靈敏度定標(biāo)準(zhǔn)確避免因激發(fā)光多次照射而影響熒光強(qiáng)度，可選擇一種激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)與之近似而對(duì)光穩(wěn)定的物質(zhì)配成適當(dāng)濃度的溶液，作為基準(zhǔn)溶液。 在測(cè)定供試品溶液時(shí)用基準(zhǔn)溶液代替對(duì)照品溶液校正儀器的靈敏度。（5）熒光衍生化試劑（6）取樣少，方法快速,2.含量測(cè)定 在每次測(cè)定前，用一定濃度的對(duì)照品溶液校正儀器的靈敏度；然后在相同條件下，讀取對(duì)照品溶液及其試劑空白的熒光讀數(shù)與供試品溶液及其試劑空白的熒光讀數(shù)，用下式計(jì)算供試品濃度：,應(yīng)在0.50-2.0之間,（三）色譜分析法 根據(jù)其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與

9、排阻色譜等。 根據(jù)分離方法分為：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。 色譜分析法具有高靈敏度（可達(dá)10-12g/ml一10-15g/ml）、高選擇性、高效能、高速度及應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。,（1）高效液相色譜法 高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測(cè)器，色譜信號(hào)由記錄儀或積分儀記錄。,1.儀器為高效液相色譜儀。 色譜柱的填充劑和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常

10、用。 Ch. P(2000)中，常以甲醇一水，或加有乙睛、緩沖液、反離子物質(zhì)等為流動(dòng)相。 注樣量一般為數(shù)微升。柱溫一般為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。,正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得任意改變外、其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相、各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖20分鐘內(nèi)記錄完畢。,2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，兩種方法：2.1 用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；2.2 規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理

11、論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。,（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）：在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR和半峰高寬（Wh/2）按 n=5.54（tR/Wh/2 ）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長(zhǎng)、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。,（2）分離度：定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度，分離度（R）的計(jì)算公式為：,除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。,（3）重復(fù)性：取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5

12、次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。 也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%,100%和120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。,（4）拖尾因子：為保證測(cè)量精度，特別當(dāng)采用峰高法測(cè)量時(shí)，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子（T）是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。 拖尾因子計(jì)算公式為：,除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95一1.05之間。,3.測(cè)定法 定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。測(cè)定供試品中主成分含量時(shí)，常用兩種方法：,(1)內(nèi)

13、標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中主成分含量：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取藥物對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測(cè)定用的藥物對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：,式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積（或峰高）,AR為藥物對(duì)照品的峰面積（或峰高），Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度，CR為藥物對(duì)照品的濃度。 再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：,式中Ax為供試品峰面積（或峰高），Cx為供試品的濃度,f為校正因子,As和Cs分別為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積（或峰

14、高）和濃度。 當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。,（2）外標(biāo)法測(cè)定供試品中主成分含量：外標(biāo)法是以供試品的對(duì)照品或標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照物質(zhì)，相比較以求得供試品的含量，要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確及操作條件穩(wěn)定。 外標(biāo)法可分為標(biāo)準(zhǔn)曲線法和外標(biāo)一點(diǎn)法。,1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，在同一操作條件下，按同量注入色譜儀，測(cè)量其峰面積（或峰高），作出峰面積（或峰高）與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在相同的條件下，注入同量供試品，測(cè)得待測(cè)組分的峰面積（或峰高），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或它的回歸方程，計(jì)算供試品中待測(cè)組分的濃度。,2）外標(biāo)一點(diǎn)法：各品

15、種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，分別配制成對(duì)照品溶液（CR）和供試品溶液（Cx），分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品的峰面積（AR)和供試品待測(cè)成分的峰面積（Ax）（或峰高），按下式計(jì)算含量：,（2）氣相色譜法 氣相色譜法的流動(dòng)相為氣體，稱為載氣；色譜柱分為填充柱和毛細(xì)管柱兩種，填充柱內(nèi)裝吸附劑、高分子多孔小球或涂潰固定液的載體。毛細(xì)管柱內(nèi)壁或載體經(jīng)涂漬或交聯(lián)固定液。注入進(jìn)樣口的供試品被加熱氣化，并被載氣帶入色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，先后進(jìn)入檢測(cè)器，色譜信號(hào)用記錄儀或數(shù)據(jù)處理器記錄。,1.對(duì)儀器的一般要求 儀器為氣相色譜儀。除另有規(guī)定外，載氣為氮?dú)?、氫氣、氦氣；色譜柱為填充柱或毛細(xì)管柱，填充柱的材質(zhì)為不銹鋼或玻璃，載體用經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球；常用玻璃或彈性石英毛細(xì)管柱的內(nèi)徑為0.20mm或0.32mm。進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫3050；進(jìn)樣量一般不超過數(shù)微升。檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)溫度一般高