topo克隆和點(diǎn)突變.ppt

1、TOPO 克隆技術(shù)與基因定點(diǎn)突變技術(shù),北京全式金生物技術(shù)有限公司 ,背景資料,基因克隆是分子生物學(xué)必不可少的工具，傳統(tǒng)的T4 DNA Ligase方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。 TOPO克隆5分鐘快速克隆，是克隆技術(shù)的革命。這個(gè)技術(shù)上的飛躍為實(shí)現(xiàn)“加速科研”的理念提供了先決條件。 基因定點(diǎn)突變技術(shù)改造基因的便利方法?；蚬δ苎芯恳呀?jīng)成為生命科學(xué)研究的新熱點(diǎn)，因此需要強(qiáng)有力的工具保證基因結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系研究的進(jìn)行。,TOPO克隆技術(shù),TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的關(guān)鍵 TOPO克隆常見問(wèn)題及解決方法,TOPO克隆原理,TOPO即Topoisomerase 拓?fù)洚悩?gòu)酶 特點(diǎn)： 由316個(gè)氨

2、基酸組成 識(shí)別5-CCCTT-3 同時(shí)具有限制性內(nèi)切酶和連接酶的功能 不需要能量,TOPO克隆原理,TOPO克隆過(guò)程,TOPO克隆過(guò)程,TOPO克隆迅速、便捷,TOPO克隆克隆策略,有無(wú)雜帶？有無(wú)引物二聚體？,基因克隆、轉(zhuǎn)化,TOPO克隆和傳統(tǒng)T4克隆比較,TransGen TOPO Vector,pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expres

3、sion Vetor pEASY-E2 Expression Vetor,克隆載體圖譜TA Cloning,克隆載體圖譜Blunt Cloning,表達(dá)載體TA Cloning,一步法載體構(gòu)建藉由TOPO技術(shù)實(shí)現(xiàn)!,TOPO克隆成功的關(guān)鍵,引物設(shè)計(jì) PCR條件 克隆反應(yīng)設(shè)置（DNA加入量、反應(yīng)的溫度和時(shí)間） 克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇 選用質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒,引物設(shè)計(jì)： 引物不能磷酸化； 引物5端第一個(gè)堿基會(huì)影響下游的連接效率； PCR注意事項(xiàng)： 后延伸設(shè)置為721020分鐘； 目的： 保證擴(kuò)增片段完整，可以有效降低擴(kuò)增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶擴(kuò)增時(shí)，該步驟相當(dāng)于加A反應(yīng)。,

4、目的片段加入量為保證良好的連接效率，推薦如下 700bp以及更小的片段：保證20ng 700bp以上的片段：保證30100ng 2Kbp左右的片段：保證40ng 3Kbp左右的片段：保證60ng 片段加入量max：4l，濃度很低時(shí)也有一定的連接效率， 體積大于5 l會(huì)破壞反應(yīng)體系平衡； 片段加入量min：0.5l，濃度很高時(shí)需要稀釋， 可以補(bǔ)充無(wú)菌水方便操作。 反應(yīng)溫度： TOPO酶的工作溫度為2037,反應(yīng)時(shí)間：,克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇：,選擇質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒： 試劑品質(zhì)很關(guān)鍵 質(zhì)量不好的試劑盒很可能會(huì)抑制下游連接,TOPO克隆常見問(wèn)題及解決方法,克隆數(shù)少（確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞效率正

5、常時(shí)） 克隆陽(yáng)性率低 PCR鑒定重組子失敗 菌落多為淡藍(lán)色或FishEye（白邊藍(lán)芯）,克隆數(shù)少或陽(yáng)性率低：,上述五種情況，均需要適當(dāng)延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間！以保證連接效率和克隆數(shù)。（可參考上文的載體連接反應(yīng)時(shí)間） 另外每種情況也有一些特別的地方可以改進(jìn)，進(jìn)一步提高克隆效果。,PCR產(chǎn)物不新鮮： Why 3端熱力學(xué)不穩(wěn)定，3“A”容易脫落 直接導(dǎo)致TA克隆效率低 How PCR產(chǎn)物置于4保存12天內(nèi)使用 不要冷凍PCR產(chǎn)物 PCR結(jié)束后立即使用效果最好,克隆膠回收片段： Why 紫外照射和EB對(duì)dsDNA造成損傷； (受到損傷的DNA不是連接的最佳底物) 3-“A”容易在電泳過(guò)程中被核酸外切酶降解，

6、導(dǎo)致TA連接效率低； 試劑殘留的抑制。 How 操作中通過(guò)細(xì)節(jié)注意避免,目的片段濃度很低： Why 無(wú)法保證有效碰撞 How 濃縮DNA,毒基因： Why其本底表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主生長(zhǎng)有明顯抑制 How 選用Top10,基因特殊結(jié)構(gòu)： Why 具有高AT、高GC、反向重復(fù)序列的基因，不容易連接 How 調(diào)整、摸索連接體系和條件 嘗試不同的載體，不同的骨架對(duì)片段偏好性不同,PCR鑒定重組子失?。?現(xiàn)象：用通用引物鑒定時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物既無(wú)目的帶又無(wú)載體自連帶 How 預(yù)變性95 10min （徹底裂解菌體、釋放DNA） 最好能用通用引物鑒定,菌落多為淡藍(lán)色或FishEye： Why 插入片段沒(méi)有影響LacZ

7、基因讀碼框 插入片段?。ㄐ∮?00bp） How 不要丟棄平板！ 進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,基因定點(diǎn)突變技術(shù),利用PCR實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變的幾種傳統(tǒng)方法 GeneTailor，QuickChange， Easy /Fast Mutagenesis System 三種市售點(diǎn)突變?cè)噭┖械谋容^,傳統(tǒng)方法：僅利用PCR,反向PCR定點(diǎn)突變 重疊延伸PCR定點(diǎn)突變 大引物PCR定點(diǎn)突變,反向PCR： 特點(diǎn)： 必須以質(zhì)粒為模板； 引物方向相反； 引物需要磷酸化。,重疊延伸PCR： 特點(diǎn)：兩輪PCR,大引物PCR： 特點(diǎn)：兩輪PCR,GeneTailor，QuickChange，Easy/Fast Mutagenesis S

8、ystem也是基于PCR原理實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變，但它們與傳統(tǒng)方法的區(qū)別主要在于可以對(duì)突變克隆進(jìn)行初步的篩選 篩選原理：降解甲基化質(zhì)粒模板 篩選依據(jù)： 來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒99%發(fā)生甲基化； PCR是去甲基化過(guò)程，PCR產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）是去甲基化的產(chǎn)物。,篩選方法： 體內(nèi)降解：原始質(zhì)粒模板可以被能降解甲基化質(zhì)粒的大腸桿菌（DMT）降解，而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會(huì)被降解。 體外降解：DpnI識(shí)別序列5-GmATC-3（在DNA序列中，一般每256bp中出現(xiàn)一次）。甲基化模板可被DpnI識(shí)別、切割，而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會(huì)被降解。,Invitrogen：GeneTail

9、or Mutagenesis System,優(yōu)點(diǎn) 引物部分重疊，指數(shù)擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物可見，易于操作 篩選方法：DMT體內(nèi)降解 缺點(diǎn)： 突變點(diǎn)在一條引物上 無(wú)DpnI限制性內(nèi)切酶降解模板,Stratagene：QuickChange Mutagenesis System,優(yōu)點(diǎn)： 篩選方法：DpnI限制性內(nèi)切酶 缺點(diǎn)： 引物完全重疊，線性擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物不可見，可操作性差 擴(kuò)增產(chǎn)物為線狀 無(wú)DMT體內(nèi)消化降解模板,TransGen:Easy/Fast Mutagenesis System,共有部分：PCR組分、DpnI酶、DMT細(xì)胞 Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶 Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶 擴(kuò)增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，擴(kuò)增10Kb左右的質(zhì)粒只需2個(gè)小時(shí)！ （請(qǐng)參考金品是怎樣煉成的）,TransGen：,引物部分重疊，指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可見