topo克隆和點突變.ppt

1、TOPO 克隆技術與基因定點突變技術,北京全式金生物技術有限公司 ,背景資料,基因克隆是分子生物學必不可少的工具，傳統(tǒng)的T4 DNA Ligase方法實驗周期長。 TOPO克隆5分鐘快速克隆，是克隆技術的革命。這個技術上的飛躍為實現(xiàn)“加速科研”的理念提供了先決條件。 基因定點突變技術改造基因的便利方法。基因功能研究已經(jīng)成為生命科學研究的新熱點，因此需要強有力的工具保證基因結構和功能關系研究的進行。,TOPO克隆技術,TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的關鍵 TOPO克隆常見問題及解決方法,TOPO克隆原理,TOPO即Topoisomerase 拓撲異構酶 特點： 由316個氨

2、基酸組成 識別5-CCCTT-3 同時具有限制性內(nèi)切酶和連接酶的功能 不需要能量,TOPO克隆原理,TOPO克隆過程,TOPO克隆過程,TOPO克隆迅速、便捷,TOPO克隆克隆策略,有無雜帶？有無引物二聚體？,基因克隆、轉(zhuǎn)化,TOPO克隆和傳統(tǒng)T4克隆比較,TransGen TOPO Vector,pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expres

3、sion Vetor pEASY-E2 Expression Vetor,克隆載體圖譜TA Cloning,克隆載體圖譜Blunt Cloning,表達載體TA Cloning,一步法載體構建藉由TOPO技術實現(xiàn)!,TOPO克隆成功的關鍵,引物設計 PCR條件 克隆反應設置（DNA加入量、反應的溫度和時間） 克隆感受態(tài)細胞的選擇 選用質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒,引物設計： 引物不能磷酸化； 引物5端第一個堿基會影響下游的連接效率； PCR注意事項： 后延伸設置為721020分鐘； 目的： 保證擴增片段完整，可以有效降低擴增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶擴增時，該步驟相當于加A反應。,

4、目的片段加入量為保證良好的連接效率，推薦如下 700bp以及更小的片段：保證20ng 700bp以上的片段：保證30100ng 2Kbp左右的片段：保證40ng 3Kbp左右的片段：保證60ng 片段加入量max：4l，濃度很低時也有一定的連接效率， 體積大于5 l會破壞反應體系平衡； 片段加入量min：0.5l，濃度很高時需要稀釋， 可以補充無菌水方便操作。 反應溫度： TOPO酶的工作溫度為2037,反應時間：,克隆感受態(tài)細胞的選擇：,選擇質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒： 試劑品質(zhì)很關鍵 質(zhì)量不好的試劑盒很可能會抑制下游連接,TOPO克隆常見問題及解決方法,克隆數(shù)少（確認感受態(tài)細胞效率正

5、常時） 克隆陽性率低 PCR鑒定重組子失敗 菌落多為淡藍色或FishEye（白邊藍芯）,克隆數(shù)少或陽性率低：,上述五種情況，均需要適當延長連接反應時間！以保證連接效率和克隆數(shù)。（可參考上文的載體連接反應時間） 另外每種情況也有一些特別的地方可以改進，進一步提高克隆效果。,PCR產(chǎn)物不新鮮： Why 3端熱力學不穩(wěn)定，3“A”容易脫落 直接導致TA克隆效率低 How PCR產(chǎn)物置于4保存12天內(nèi)使用 不要冷凍PCR產(chǎn)物 PCR結束后立即使用效果最好,克隆膠回收片段： Why 紫外照射和EB對dsDNA造成損傷； (受到損傷的DNA不是連接的最佳底物) 3-“A”容易在電泳過程中被核酸外切酶降解，

6、導致TA連接效率低； 試劑殘留的抑制。 How 操作中通過細節(jié)注意避免,目的片段濃度很低： Why 無法保證有效碰撞 How 濃縮DNA,毒基因： Why其本底表達產(chǎn)物對宿主生長有明顯抑制 How 選用Top10,基因特殊結構： Why 具有高AT、高GC、反向重復序列的基因，不容易連接 How 調(diào)整、摸索連接體系和條件 嘗試不同的載體，不同的骨架對片段偏好性不同,PCR鑒定重組子失敗： 現(xiàn)象：用通用引物鑒定時，擴增產(chǎn)物既無目的帶又無載體自連帶 How 預變性95 10min （徹底裂解菌體、釋放DNA） 最好能用通用引物鑒定,菌落多為淡藍色或FishEye： Why 插入片段沒有影響LacZ

7、基因讀碼框 插入片段?。ㄐ∮?00bp） How 不要丟棄平板！ 進行進一步鑒定,基因定點突變技術,利用PCR實現(xiàn)點突變的幾種傳統(tǒng)方法 GeneTailor，QuickChange， Easy /Fast Mutagenesis System 三種市售點突變試劑盒的比較,傳統(tǒng)方法：僅利用PCR,反向PCR定點突變 重疊延伸PCR定點突變 大引物PCR定點突變,反向PCR： 特點： 必須以質(zhì)粒為模板； 引物方向相反； 引物需要磷酸化。,重疊延伸PCR： 特點：兩輪PCR,大引物PCR： 特點：兩輪PCR,GeneTailor，QuickChange，Easy/Fast Mutagenesis S

8、ystem也是基于PCR原理實現(xiàn)點突變，但它們與傳統(tǒng)方法的區(qū)別主要在于可以對突變克隆進行初步的篩選 篩選原理：降解甲基化質(zhì)粒模板 篩選依據(jù)： 來自大腸桿菌的質(zhì)粒99%發(fā)生甲基化； PCR是去甲基化過程，PCR產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）是去甲基化的產(chǎn)物。,篩選方法： 體內(nèi)降解：原始質(zhì)粒模板可以被能降解甲基化質(zhì)粒的大腸桿菌（DMT）降解，而去甲基化的擴增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會被降解。 體外降解：DpnI識別序列5-GmATC-3（在DNA序列中，一般每256bp中出現(xiàn)一次）。甲基化模板可被DpnI識別、切割，而去甲基化的擴增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會被降解。,Invitrogen：GeneTail

9、or Mutagenesis System,優(yōu)點 引物部分重疊，指數(shù)擴增 擴增產(chǎn)物可見，易于操作 篩選方法：DMT體內(nèi)降解 缺點： 突變點在一條引物上 無DpnI限制性內(nèi)切酶降解模板,Stratagene：QuickChange Mutagenesis System,優(yōu)點： 篩選方法：DpnI限制性內(nèi)切酶 缺點： 引物完全重疊，線性擴增， 擴增產(chǎn)物不可見，可操作性差 擴增產(chǎn)物為線狀 無DMT體內(nèi)消化降解模板,TransGen:Easy/Fast Mutagenesis System,共有部分：PCR組分、DpnI酶、DMT細胞 Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶 Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶 擴增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，擴增10Kb左右的質(zhì)粒只需2個小時！ （請參考金品是怎樣煉成的）,TransGen：,引物部分重疊，指數(shù)擴增，擴增產(chǎn)物可見