酶的定向進(jìn)化.ppt

1、酶的定向進(jìn)化,主要內(nèi)容,一 酶定向進(jìn)化的概念 二 酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程 三 基于易錯(cuò)PCR的黃曲酶毒素解毒酶體外分子 定向進(jìn)化,概念,酶定向進(jìn)化：是模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過(guò)程。,酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程 隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫(kù)、定向選擇,常用的隨機(jī)突變方法 1 易錯(cuò)PCR技術(shù)（error-prone PCR ） 2 DNA重排技術(shù)（DNA shuffling） 交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)(StEP) 隨機(jī)引物體外重組技術(shù)(RPR) 3 基因家族重排技術(shù)

2、(DNA family shuffling）,常用的高通量篩選技術(shù) 1 平板篩選法 2 熒光篩選法 3 噬菌體表面展示法 4 細(xì)胞表面展示法 5 核糖體表面展示法,實(shí)驗(yàn) 基于易錯(cuò)PCR的黃曲霉毒素解毒酶體外分子 定向進(jìn)化 結(jié)果 突變酶A1773：耐高溫70 突變酶A1476：pH4.0穩(wěn)定性 突變酶A2863：pH4.0和pH7.5穩(wěn)定性,易錯(cuò)PCR技術(shù) 定義：從單一基因出發(fā)，通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件，在基因擴(kuò)增過(guò)程中使堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤而引起基因突變。 過(guò)程：雙鏈DNA變性（解鏈；8595） 引物與單鏈DNA結(jié)合（退火；5070 ） 引物延伸（半保留復(fù)制； 7075 ） 條件：增加Mg2（穩(wěn)定非

3、互補(bǔ)的堿基對(duì)） 添加Mn2（降低聚合酶的特異性） 4種底物的濃度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTP),易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系（20 L）: 10PCR 緩沖液2L dATP (10 mmol/L) 和dGTP (10 mmol/L) 各0.4 L ，dCTP (10 mmol/L) 和dTTP (10 mmol/L) 各2 L 模板pKLAC1- adtz 0.2 L 上下游引物 (10 mol/L) 各0.6 L MgCl2 (25 mmol/L) 4.4 L MnCl2 (2 mmol/L) 0 、0.8、2 、4 、6 、8 L Taq DNA 聚合酶0.2 L ddH2O 8、6 、4 、2 、0.8、0 L,易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的建立,限制性內(nèi)切酶：Xho和Not 載體：大腸桿菌-釀酒酵母穿梭分泌表達(dá)載體pYES2CT-factor(簡(jiǎn)寫為pYC) 連接酶：T4DNA連接酶 宿主菌：大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞 釀酒酵母S.cerevisiae BJ5465感受 態(tài)細(xì)胞,辣