2013年最新高中生物精品教學(xué)課件：血紅蛋白的提取和分離(3)(人教版選修1)

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離,專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),2003年4月14日宣布人類基因組序列圖 完成這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時(shí)代和蛋 白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用， 首先要得到純凈的蛋白質(zhì)。在本課堂中， 我們就一起來(lái)學(xué)校蛋白質(zhì)的提取和分離。,蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？,根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同蛋白質(zhì)。,思考,一、基礎(chǔ)知識(shí)：, 凝膠色譜法（分配色譜法）：,1、凝膠：,一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）,2、概念：根據(jù)被分離

2、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離的方法。,3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)（ ）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），而（ ）的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（ ）移動(dòng)，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。,4、具體過(guò)程,相對(duì)分子質(zhì)量較小,較長(zhǎng),較慢,相對(duì)分子質(zhì)量較大,凝膠外部,較短,較快,凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理,1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。, 緩沖溶液：,2、作用： 能夠抵制

3、（ ）的對(duì)溶液的（ ）的影響，維持PH基本不變。,外界的酸或堿,PH值,3、緩沖溶液的配制,通常由（ ）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ）就可以制得（ ）使用的緩沖液。,12,使用比例,在不同PH范圍內(nèi),思考：說(shuō)出人體血液中緩沖液。,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,電泳：,1、概念：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā) 生遷移的過(guò)程。,在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）,2、原理：許多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，這些

4、基團(tuán)會(huì)帶上（ ） 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其（ ） 移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（ ），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,多肽、核酸,可解離的基團(tuán),正電或負(fù)電,所帶電荷相反的電極,帶電性質(zhì)的差異,大小,形狀,遷移速度,一定的PH,分類：,瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。,測(cè)定（ ）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量,為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入( )。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是(

5、)。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于( )。,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。,SDS,單條肽鏈的分子量,分子的大小,思考 人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人 的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？,雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。,樣品處理粗分離純化純度鑒定,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：,二 實(shí)驗(yàn)操作,1.樣品,血液,血漿,水分,固體物質(zhì),血

6、漿蛋白,無(wú)機(jī)鹽 磷脂 葡萄糖等,血細(xì)胞,白細(xì)胞,血小板,紅細(xì)胞 （最多）,血紅蛋白 （ ）,兩個(gè)a肽鏈,兩個(gè)一肽鏈,共四條肽鏈,90,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色。,（一）樣品處理,1、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌，重復(fù)三次直至上清液不再呈現(xiàn)黃色。 2、血紅蛋白的釋放： 3、分離血紅蛋白溶液： 4、透析：,紅細(xì)胞的洗滌,（一）樣品處理,1、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生

7、理鹽水洗滌。 2、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放 3、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過(guò)濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。 4、透析：,分離血紅蛋白溶液,有機(jī)溶劑 無(wú)色透明的甲苯層,脂類物質(zhì) 白色薄層固體（脂溶性物質(zhì)沉淀層）,血紅蛋白溶液 紅色透明液體,紅細(xì)胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀物,（一）樣品處理,1、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。 2、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放 3、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過(guò)濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色

8、透明液體。 4、透析： 裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。,透析過(guò)程,視頻（3.38）,（二）凝膠色譜操作,（1）凝膠色譜柱的制作： 取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。,（2）凝膠色譜柱的裝填,凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表

9、示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。 凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。,視頻（2.14）,洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)，使凝膠裝填緊密。注

10、意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,（3）樣品加入與洗脫,調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱

11、底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功） 注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,視頻（6.30）,（三）純度鑒定,使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。,二、實(shí)驗(yàn)操作,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： （1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白的釋放；離心等操作收集血紅蛋白溶液。 （2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。 （3）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。 （4）純度鑒定：通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。,視頻（2.14）,練習(xí)鞏固,1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做的一步是 A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能 C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程 D 獲得高純度的蛋白質(zhì),2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是 A 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) B 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) C 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) D 二者根本無(wú)法比較,3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于 A 電荷的多少 B 分子的大小 C