蔗糖酶的分離提取及活力測定.ppt

1、20031021,1,蔗糖酶的分離提取及活力測定,課件編寫制作、講授及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：郭慧云,20031021,2,一、目的要求,1.學(xué)習(xí)掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖 的原理和方法； 2.學(xué)習(xí)酶蛋白分離提取的原理； 3.學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破壁及抽提技術(shù)； 4.學(xué)習(xí)掌握酶活力測定及其計(jì)算的方法。,20031021,3,1、3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理 1）DNS試劑+ D-葡萄糖 氨基化合物 （還原糖） （棕紅色） 2）在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng) 度成一定比例關(guān)系。所以，可用DNS比色法測 定還原糖的含量。 3）該方法是半微量定糖法，操作簡便、快速、雜 質(zhì)干擾較少。,二、實(shí)驗(yàn)原理,強(qiáng)

2、堿性溶液中,沸水浴中,20031021,4,2、蔗糖酶活力測定的原理,2）DNS試劑+ D-葡萄糖 氨基化合物 （還原糖） （棕紅色） 3）在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成一 定比例關(guān)系，所以可用DNS比色法測定還原糖的含量。 4）在一定條件下，蔗糖酶催化反應(yīng)產(chǎn)生D-葡萄糖的量一 定。所以，可用DNS比色定糖法測定蔗糖酶的活力。,1）蔗糖酶催化的反應(yīng)：蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖,沸水浴中,強(qiáng)堿性溶液中,20031021,5,3、蔗糖酶分離提取的原理,1）細(xì)胞破壁：就酶在生物體內(nèi)的分布，可分為胞內(nèi)酶和胞外酶，蔗糖酶系胞內(nèi)酶。提取胞內(nèi)酶時(shí)，要破碎組織和細(xì)胞，然后用一定的溶液提取，得

3、到的材料稱為無細(xì)胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。 我們用的菌體（微生物）細(xì)胞破壁方法是：自溶法，即將菌體放在適當(dāng)?shù)膒H值和溫度下，利用組織細(xì)胞自身的酶系將細(xì)胞壁破壞，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來。 自溶時(shí)需加少量防腐劑，以防外界細(xì)菌污染。 自溶法的缺點(diǎn)是時(shí)間較長。,20031021,6,2）抽提：,抽提（或叫萃?。┦菍⒁哑扑榧?xì)胞壁的材料置于一定的條件及溶劑中，使被提取物釋放出來的過程。 抽提液可用水或有機(jī)溶劑。大部分酶蛋白能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸中。對于普通的酶多采用緩沖液，有利于酶的穩(wěn)定。而一些與脂質(zhì)結(jié)合較牢固的酶，常用有有機(jī)溶劑提取。 抽提時(shí)緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值以及溫度的選擇，應(yīng)既有

4、利于酶的提取又保證酶的穩(wěn)定。,20031021,7,三、試劑和器材,（一）試劑： 1. 3,5二硝基水楊酸試劑(DNS) 4. 5%的蔗糖溶液 2. 1mol/L的 NaOH溶液 5. 乙酸鈉 3. 0.2mol/L,pH4.6的醋酸緩沖液 6. 乙酸乙酯 （二）器材： 1燒杯、攪拌棒、滴管 2. 量筒、移液管、吸耳球 3試管、血糖管（或刻度試管）4秒表、天平 5冰鹽浴、沸水浴 6恒溫水浴 7. 離心機(jī)、內(nèi)外套管 8. 冰柜 9分光光度計(jì) 、比色杯、鏡頭紙、濾紙 10. 高活性干酵母粉、硫酸紙、皮筋套 11保溫烘箱（恒溫在35 過夜）,20031021,8,四、操作步驟,1、蔗糖酶的分離提?。?/p>

5、選材、破壁、提取、分離 自溶：10g高活性干酵母粉倒入250ml燒杯中、少量多次地加入20ml蒸餾水，攪拌均勻，成糊狀后加入1.0g乙酸鈉、15ml乙酸乙酯，攪勻，再于35 恒溫水浴中攪拌30分鐘，觀察菌體自溶現(xiàn)象。 抽提：補(bǔ)加蒸餾水20ml，攪勻，蓋好，于35 恒溫過夜；24-36小時(shí)后，4000r/min 離心30min，棄沉淀及脂層，得無細(xì)胞提取液，量體積V=（ ）ml ；置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力。,20031021,9,2、 工作曲線的制作 取7支血糖管編號17，按下頁表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、去離子水、3，5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時(shí)放入沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5mi

6、n，取出后立即用流動(dòng)的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，用723分光光度計(jì)測定540nm處的A值。 以葡萄糖(mg)含量為橫坐標(biāo)、A540值為縱坐標(biāo)， 在723分光光度計(jì)上讀出工作曲線的K值、b值和r 值。,20031021,10,3，5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作,20031021,11,3、蔗糖酶的活力測定： .蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實(shí)驗(yàn)條件下，每3min釋 放1mg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。 .操作： 取兩支試管分別加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸緩沖 液適當(dāng)稀釋過的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活（做對照），另

7、一支做測定管； 把兩支試管和5%的蔗糖溶液都放在35水浴中預(yù)熱恒溫；上述兩試管中分別加入2ml 5%的蔗糖液，并準(zhǔn) 確計(jì)算時(shí)間，3分鐘后于測定管中加入 0.5ml 1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。,20031021,12,.從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入 3ml 3,5 二硝基水揚(yáng)酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸 水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min，立即用冷水冷卻，加去離子水 水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測光密度。 .在723分光光度計(jì)上，可指示出光密度值所對應(yīng)的葡 萄糖含量，按下面公式計(jì)算酶活力： 蔗糖酶活力單位=葡萄糖毫克數(shù)9酶的稀釋倍數(shù),20031021,13,

8、五、注意事項(xiàng),1.工作曲線的使用：不許延長，因?yàn)楸榷?只適用于稀溶液中的反應(yīng)。 2.測定酶活力時(shí)的顯色反應(yīng)： 一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管， 且不要用大玻璃杯代替沸水浴鍋； 用秒表記時(shí)，取出后立即用流動(dòng)的冷水冷 卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定 540nm處的A值。 3. 酶是有生物活性的蛋白質(zhì)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程 中都要注意防止酶失活。,20031021,14,20031021,15,六、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理,1.原始數(shù)據(jù)： 1）制作葡萄糖工作曲線的數(shù)據(jù)（列表） 2）葡萄糖工作曲線的K值、b值和r值 3）無細(xì)胞抽提液的體積（ml） 4）測酶活時(shí)的稀釋倍數(shù)、A540值 2.數(shù)據(jù)處理：

9、1）蔗糖酶活力單位=葡萄糖毫克數(shù)9稀釋倍數(shù) 2）蔗糖酶濃度=蔗糖酶活力單位/2ml E=葡萄糖mg數(shù)（4.5/0.5）E稀釋倍數(shù)/2ml =（ ）u/ml 2）蔗糖酶總活力=酶濃度無細(xì)胞提取液的體積V 總活力：EV =（ ）u,20031021,16,七、思考題,1、簡述蔗糖酶分離提取的原理及操作步驟。 2、3，5-二硝基水楊酸比色定糖法的原理及 操作注意事項(xiàng)。 2、用723分光光度計(jì)制作工作曲線的要求。 3、蔗糖酶活力測定的原理及兩個(gè)反應(yīng)。 4、在酶分離提純的整個(gè)過程中應(yīng)注意的一 個(gè)關(guān)鍵問題是什么？,2002-9-4,17,附：本實(shí)驗(yàn)的原版,蔗糖酶的分離提純及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 為必修、綜合性大實(shí)驗(yàn)，講授8學(xué)時(shí)、實(shí)驗(yàn)40學(xué)時(shí) （講授含：酶學(xué)實(shí)驗(yàn)和實(shí)用正交試驗(yàn)方法的上篇各4學(xué)時(shí)） 課件編寫制作、講授及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：郭慧云,2002-9-4,18,原版簡介,1、 3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）工作曲線的制 作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2 、E3）酶活力的測定； 2、 Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作及三種蔗 糖酶樣品（E1、E2 、E3）蛋白質(zhì)含量的測定； 3、蔗糖酶的分離提純（細(xì)胞破壁、抽提、有機(jī)溶