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1、第四章 天然酶的純化與制備,天然酶制備的基本步驟,天然酶的制備一般包括三個(gè)基本步驟： 酶的提取 酶的分離純化 酶的結(jié)晶或制劑,第一節(jié) 天然酶的一般制備方法,酶的分離純化是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。 研究酶的性質(zhì)、作用、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、闡明代謝途徑，作為工具酶等都需要高度純化的酶制劑。 如基因工程中所使用的各種工具酶都有高純度的要求，內(nèi)切酶中不能含有外切酶，反之一樣，否則結(jié)果無法判斷。,一、酶的提取,酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。也稱作酶的抽提。,一、酶的提取,酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。大多?shù)酶能溶解于水，可用水或稀

2、酸、稀堿、稀鹽溶液提?。挥行┟概c脂質(zhì)結(jié)合或含較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。,酶提取的主要方法,根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。,二、酶的分離純化方法,酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以用于蛋白質(zhì)的分離純化方法一般適用于酶的分離純化。此外酶是具有催化功能的蛋白質(zhì)，因此根據(jù)酶與底物、底物結(jié)構(gòu)類似物、輔助因子、抑制劑等的特異親和力可發(fā)展酶獨(dú)特的親和層析技術(shù)。所有的分離純化方法，都是根據(jù)被分離物質(zhì)間的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的差異而設(shè)計(jì)出來的

3、。,鹽析法,一般蛋白質(zhì)在低離子強(qiáng)度介質(zhì)中表現(xiàn)為鹽溶(salted in)、而在高離子強(qiáng)度介質(zhì)中表現(xiàn)為鹽析(salted out)，但不同的蛋白質(zhì)鹽析所需的離子強(qiáng)度不同。鹽析法就是建立在此原理的種簡便有效的分離方法。,鹽析法,硫酸銨是最常用的鹽，因其在水中溶解度大，且受溫度影響小，對(duì)酶不僅無害處。而且還起穩(wěn)定作用分級(jí)效果較好且價(jià)廉易得?？刹捎茫篴加固體粉末鹽；b加飽和鹽溶液；c. 對(duì)濃鹽溶液進(jìn)行透析等方式。一般對(duì)于大體積樣品采用a，對(duì)于小體積樣品采用b或c。通常層析洗脫液蛋白質(zhì)濃度低，采用c方式沉淀蛋白質(zhì)很方便。,有機(jī)溶劑沉淀法,隨著有機(jī)溶劑的加入，介質(zhì)的介電常數(shù)下降，使蛋白質(zhì)分子間靜電作用力增

4、強(qiáng)；同時(shí)有機(jī)溶劑還可降低蛋白質(zhì)分子表面的水合程度，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降直至最后沉淀下來。,有機(jī)溶劑沉淀法,最常使用的有機(jī)溶劑是乙醇、丙酮等。由于有機(jī)溶劑能使酶變性，一般應(yīng)在低溫下操作。同時(shí)宜加入適量中性鹽，可增加蛋白質(zhì)溶解度降低變性作用，并提高分級(jí)效果。使用有機(jī)溶劑沉淀酶有兩種方式：其一，如上所述，用乙醇或丙酮分級(jí)沉淀目的酶。其二，若目的酶在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性強(qiáng)，可采用變性雜蛋白方式，使酶得到初步純化。,等電點(diǎn)沉淀法,當(dāng)介質(zhì)的pH值與某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)相等該蛋白質(zhì)分子間的排斥力最小其溶解度亦最小，易于沉淀。因此可通過調(diào)節(jié)介質(zhì)pH值把目的酶與雜蛋白分開。此種沉淀法亦受介質(zhì)離子強(qiáng)度等因素的

5、影響。由于蛋白質(zhì)在pI附近一定范圍的pH值下都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，再者相當(dāng)多的蛋白質(zhì)pI點(diǎn)很靠近，所以該法的分級(jí)效果和回收率均不理想一般只用在酶的粗分離階段。,凝膠過濾層析,它又稱凝膠過濾、分子篩層析、凝膠滲透層析、排阻層析。它是依據(jù)分子篩效應(yīng)，按分子的大小和形狀來分離樣品。因此它也可用于蛋白質(zhì)分子量的測定。此法具有條件溫和，操作簡便，層析柱可反復(fù)使用無需再生處理等優(yōu)點(diǎn)。,離子交換層析,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。不同蛋白質(zhì)出于其pI不同，在同一種pH值介質(zhì)中電離狀況會(huì)不同，分子所帶電荷的種類和數(shù)量就不同與離于交換劑的靜電吸附能力亦不同。通過上樣吸附和改變離子強(qiáng)度或pH值解吸洗脫、可使

6、蛋白質(zhì)依據(jù)其靜電吸附能力由弱到強(qiáng)的順序而分離開來。這就是離子交換層析法。它是一個(gè)重要而廣泛應(yīng)用的方法。,親和層析,親和層析就是將配體共價(jià)連接到基質(zhì)上，用此種基質(zhì)填充成層析柱，利用配體與對(duì)應(yīng)的生物大分子(目的物)的專一親和力，將目的物與其它雜質(zhì)分離開。這一方法不僅可用于分離生物大分子，也可用于分離諸如病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞之類的超分子結(jié)構(gòu)。其操作與離子交換層析類似。,吸附層析,吸附層析是以吸附劑為固定相以緩沖溶液或有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的一種層析方法?？捎玫奈絼┯辛u基磷灰石、硅膠、高嶺土、纖維素、活性炭等。這些都是蛋白質(zhì)層析的經(jīng)典材料。應(yīng)選擇吸咐選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、表面積大、顆粒均勻、成本低廉的吸附劑。

7、,電泳法,電泳是帶電物質(zhì)在直流電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象 由于蛋白質(zhì)分子表面電荷的差異，應(yīng)用電泳方法可將不同的蛋白質(zhì)分子分離開來。 電泳法不僅可用于酶的純化工作，還常用于酶純度鑒定及理化性質(zhì)(如pI、亞基分子量等)測定。特別是在分離微克量蛋白質(zhì)時(shí)。,離心法,利用離心機(jī)產(chǎn)生的離心力來分離不同物質(zhì)的過程稱為離心。,膜分離法,膜分離法不僅可分離分子量差異顯著的蛋白質(zhì)，還可用于樣品的脫鹽、濃縮。酶分離純化工作中常使用各種不同材料制成的固體半透膜進(jìn)行超濾或透析。 超濾 它是依據(jù)溶液中分子的大小和形狀進(jìn)行選擇性過濾的方法,在外加壓力下，驅(qū)動(dòng)酶液中的溶劑分子和較小的溶質(zhì)分子穿過膜，而截留分

8、子量大的溶質(zhì)分子。它常用于酶液的脫鹽和濃縮。,三、酶的結(jié)晶,酶的結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結(jié)晶是酶分離純化的一種手段，它不僅為酶學(xué)研究提供了適合的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。,酶的結(jié)晶,酶在結(jié)晶時(shí)，酶液應(yīng)達(dá)到一定的濃度。濃度太低是無法析出結(jié)晶的。一般來說，酶的濃度越高，就越容易結(jié)晶。但濃度過大時(shí)，會(huì)形成很多小晶核，結(jié)晶小，不易長大。故此結(jié)晶時(shí)應(yīng)控制好酶液濃度。,1. 鹽析結(jié)晶法,在適宜的溫度和pH值等條件下，緩慢增加酶液中鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，進(jìn)行酶的結(jié)晶。 鹽析結(jié)晶所采習(xí)的中性鹽是硫酸銨，也可采用硫酸鈉等其他中性鹽。,1. 鹽析結(jié)晶法,鹽析結(jié)晶

9、時(shí)，一般是把飽和鹽溶液慢慢滴加到濃酶液中，至呈現(xiàn)稍微渾濁為止。讓其在一定溫度下(一般在0一10的低溫條件下)放置一段時(shí)間，慢慢析出結(jié)晶，再緩慢而均勻地補(bǔ)加少量飽和鹽溶液，直至結(jié)晶完全。有時(shí)也可用固體硫酸銨粉末代替。,1. 鹽析結(jié)晶法,鹽析結(jié)晶還可以采用抽提法。即將酶液先經(jīng)硫酸銨鹽析得到的酶沉淀，用較高飽和度的冰冷的硫酸銨溶液抽提，使一部分酶溶解，分離后上清液在室溫下放置，慢慢析出結(jié)晶，剩下的沉淀依次用冰冷的較低飽和度的硫酸銨溶液再行抽堤。由于低溫時(shí)酶在硫酸銨溶液中的溶解度較高，溫度升高時(shí)溶解度降低，所以當(dāng)酶的抽提液在室溫放置時(shí)，酶會(huì)慢慢析出結(jié)晶。抽提時(shí)所采用的硫酸銨溶液的飽和度應(yīng)根據(jù)酶鹽析沉淀

10、的飽和度決定。,2. 有機(jī)溶劑結(jié)晶法,在經(jīng)過濃縮和初步純化的酶液中，調(diào)節(jié)pH值到酶穩(wěn)定的pH值，用冰浴冷卻至0 左右，邊攪拌邊慢慢加入有機(jī)溶劑，當(dāng)酶液稍微出現(xiàn)渾濁時(shí)，在冰箱放置12h，離心去除沉淀，取上清液置于冰箱中讓其慢慢析出結(jié)晶。,2. 有機(jī)溶劑結(jié)晶法,有機(jī)溶劑結(jié)晶的優(yōu)點(diǎn)是含鹽少，結(jié)晶時(shí)間較短。但操作要在低溫下進(jìn)行，以免引起酶變性失活。 有機(jī)溶劑結(jié)晶常用的溶劑有乙醇、丙酮等。,3. 透析平衡結(jié)晶法,將初步純化的濃縮酶液裝在透析袋中，在一定濃度的鹽溶液或有機(jī)溶劑或一定pH的緩沖溶液中進(jìn)行透析。經(jīng)一段時(shí)間后，酶液漸漸達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶。,4. 等電點(diǎn)結(jié)晶法,通過緩慢地改變酶液的pH值，使

11、之逐步到達(dá)酶的等電點(diǎn)而使酶析出結(jié)晶。,第二節(jié) 胰酶的生產(chǎn)制備工藝,一、概述：,胰酶(Pancreatin)是從豬、牛、羊等動(dòng)物胰臟中提取得到的一種混合酶制劑。主要成分為胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶，還有羧肽酶和核酸酶等。在動(dòng)物胰臟中含有豐富的消化酶，這些酶都有為滿足機(jī)體需要的天然比例和活性。提取的藥用酶是否大致具有原胰臟中菌的天然比例和活性，與生產(chǎn)工藝有很大關(guān)系。,一、概述：,胰酶能溶于水及低濃度的乙醇，在乙醚和高濃度的乙醇中均不溶，不耐熱，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿均能使之破壞，但在中性和弱堿性的溶液中穩(wěn)定，其最適溫度40，最適pH為89。,一、概述：,胰腺經(jīng)刨碎后,內(nèi)、外肽酶、蛋白酶等以無活性的酶原形式釋

12、放于溶液,須經(jīng)激活后才具有水解消化蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪的能力。而在胰腺激活提取過程中,當(dāng)?shù)鞍酌复罅考せ詈?會(huì)隨之水解破壞同一體系內(nèi)的胰淀粉酶、胰脂肪酶等酶類物質(zhì),使活力下降,胰酶的收率降低。,二、胰酶的制備工藝流程,刨碎 激活 提取 預(yù)冷 胰腺 胰漿 胰乳 提取液 沉淀 壓榨制粒 脫脂干燥 酶沉淀物 粗酶顆粒 粉碎 胰酶原粉,三、胰酶的活性測定,胰酶的活性測定按1977版中國藥典采用酪蛋白測定方法；按1995版中國藥典采用三酶活性測定；按出口標(biāo)準(zhǔn)主要測定胰酶中所含激肽釋放酶活性。,四、胰酶的藥理作用與臨床應(yīng)用,胰酶在臨床上主要作為助消化藥，主要用于消化不良、食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障礙。

13、我國大多數(shù)生化藥廠生產(chǎn)的藥用胰酶原粉主要用于制成多酶片、胰酶片等,或作為原料藥出口到日本等國家,用于生產(chǎn)提取激肽釋放酶等高附加值藥品,而其中所含激肽釋放酶活性是其檢測的重要指標(biāo)。,第三節(jié) 胃蛋白酶的生產(chǎn)制備工藝,一、概述：,胃蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于胃粘膜中，經(jīng)胃酸激活后才能成為有活性的胃蛋白酶。 H+ 胃蛋白酶原 胃蛋白酶+胃蛋白酶抑制劑其它肽 (分子量42500） （分子量34500) (分子量3100) 胃蛋白酶易溶于水，生成帶乳光的溶液，難溶于乙醇、氯仿和乙醚等有機(jī)溶劑；最適溫度40，最適pH為1.52.0。,二、胃蛋白酶的制備工藝流程,激活提取 濃縮 去雜蛋白 胃粘膜 提取液

14、 上清液 丙酮分級(jí)沉淀 胃膜素 脫脂真空干燥 粉碎 胃蛋白酶 胃蛋白酶原粉,三、胃蛋白酶的活性測定,胃蛋白酶的活性測定按1977版中國藥典采用卵蛋白測定方法；按1995版中國藥典采用血紅蛋白活性測定；,四、胃蛋白酶的藥理作用與臨床應(yīng)用,胃蛋白酶在臨床上主要作為助消化藥。用于制成多酶片、胃酶片等,主治消化不良,食欲不振以及有關(guān)老年性疾病。,第四節(jié) 細(xì)胞色素C的生產(chǎn)制備工藝,一、概述：,細(xì)胞色素是包括多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質(zhì)總稱。它廣泛存在于各種動(dòng)物、植物組織和微生物中。細(xì)胞色素是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體，細(xì)胞色素C只是細(xì)胞色素的一種。它主要存在于線粒體中，需氧最多的組織如心肌及酵母細(xì)胞中，

15、細(xì)胞色素C含量豐富。,一、概述：,細(xì)胞色素C為含鐵卟啉的蛋白質(zhì)，分子量約為13000，蛋白質(zhì)部分由104個(gè)左右的氨基酸殘基組成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分為氧化型和還原型兩種，前者水溶液呈深紅色，后者呈桃紅色。細(xì)胞色素C對(duì)熱、酸和堿都比較穩(wěn)定，但三氯乙酸和乙酸可使之變性失活。,二、細(xì)胞色素C的制備工藝流程,絞碎 提取 中和 吸附 洗滌 洗脫 豬心 提取液 鹽析 三氯乙酸沉淀 溶解 洗脫液 細(xì)胞色素C沉淀 透析 柱層析 去熱原 制劑 細(xì)胞色素C粗品 成品,三、細(xì)胞色素C的活性測定,上述制備的細(xì)胞色素 C是還原型和氧化型的混合物，在測定時(shí)要加入聯(lián)二亞硫酸鈉，使氧

16、化型變?yōu)檫€原型。還原型細(xì)胞色素C水溶液在520nm波長處有最大吸收值，根據(jù)這一特性可用細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品，畫出濃度對(duì)吸收值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出所測樣品的含量。,四、細(xì)胞色素C的臨床應(yīng)用,細(xì)胞色素C是生物體內(nèi)細(xì)胞呼吸的重要酶,是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體，在臨床上主要用于治療腦出血、腦血管障礙、心肌梗死、一氧化碳中毒、安眠藥中毒等癥。,第五節(jié) 激肽釋放酶的生產(chǎn)制備工藝,一、概述：,激肽釋放酶(kallikrein，下簡稱K酶)屬絲氨酸蛋白酶。廣泛存在于血漿、胰、腎、頜下腺、腸、胰液、尿及蛇毒中。藥用K酶又稱血管舒緩素，主要來自頜下腺或胰腺。 K酶是一種含有唾液酸的糖蛋白，在腺體中以酶原的

17、形式存在。 K酶由二條多肽鏈組成，分子量為28600。,三、激肽釋放酶的活性測定,國內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)豬頜下腺K酶制定的。部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：注射用血管舒緩素效價(jià)每1mg不得少于10單位，口服用每1mg不得少于5個(gè)單位。 測定原理：K酶可催化水解底物BAEE生成Na苯甲酰L精氨酸和乙醇在253nm波長處，光吸收的增值與K酶在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。酶促反應(yīng)時(shí)的底物濃度采用0.510-3molL，。,四、激肽釋放酶的藥理作用與臨床應(yīng)用,K酶在機(jī)體內(nèi)系由組織蛋白水解酶催化K酶原轉(zhuǎn)變而成。形成的K酶可作用激肽原使之變成激肽。而激肽能使血管舒張與毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，從而使心血管病緩解。激肽還能增加腎皮質(zhì)血流，增

18、加腎小管毛細(xì)血管壓力，抑制腎小管對(duì)鈉的吸收，產(chǎn)生利尿作用，從而也能引起血壓下降。,四、激肽釋放酶的藥理作用與臨床應(yīng)用,1) 主要用于增加冠狀動(dòng)脈、腦、視網(wǎng)膜等處的血流量，可治療高血壓、冠狀動(dòng)脈及腦動(dòng)脈血管硬化，心絞痛、初老期循環(huán)障礙等癥。對(duì)由血液循環(huán)障礙引起的組織營養(yǎng)不良、血管痙攣、肢端感覺異常及麻木等癥也有明顯療效。 2) 本品能溶解血纖維蛋白，因此對(duì)由于血纖維蛋白在小血管中堵塞所致的血栓及炎癥有治療作用，也可外用于治療凍瘡，對(duì)血管閉塞性脈管炎也有一定療效。 3) 用于治療微循環(huán)障礙疾病，如夜間異常臂痛、小腿麻木疼痛等病。 4) 其他 有報(bào)道用K酶治療男性不育癥，用藥后精子數(shù)顯著增加。還可治

19、療圓形脫毛癥。該酶還是優(yōu)良的皮膚保護(hù)劑，也可作為老年人的保健藥物和抗衰老藥物應(yīng)用。,第六節(jié) 超氧化物歧化酶的生產(chǎn)制備工藝,一、概述：,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）簡稱SOD，廣泛存在于生物體內(nèi)，按所含金屬離子的不同，分為三種：銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、錳鋅超氧化物歧化酶 (MnZn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。SOD催化如下反應(yīng)：O2-+O2-+2H+H2O2+O2 在生物體內(nèi)，它是一種重要的自由基清除劑。,二、超氧化物歧化酶的制備工藝流程,離心 洗滌 溶血 去血紅蛋白 牛血 紅細(xì)胞 溶血液 K2HPO4分液 丙酮沉淀 溶解 粗提液

20、上清液 沉淀 透析 DE-32柱層析 G-50柱層析 SOD精品,三、超氧化物歧化酶的活性測定,采用鄰苯三酚自氧化法。鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開始后，反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g產(chǎn)物不斷氧化的結(jié)果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)。中間物在420nm波長處有強(qiáng)烈光吸收，當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化O2-和H結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間物的積累，因此，通過計(jì)算就可求出SOD的酶活性。,四、超氧化

21、物歧化酶的臨床應(yīng)用,SOD不僅在生物體內(nèi)對(duì)抗氧化、解毒等起重要作用,而且也有抗輻射、抗腫瘤及抗衰老等功能。超氧化物歧化酶能清除生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基,在炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤及輻射損傷、衰老等疾病防治方面起著十分重要的作用，,第七節(jié) 尿激酶的生產(chǎn)制備工藝,一、概述：,1861年發(fā)現(xiàn)尿中有溶解蛋白的活性物質(zhì)，隨后于1885年報(bào)道了此活性物質(zhì)有溶解纖維蛋白凝塊的功能，1952年將人尿中纖維蛋白溶酶原的激酶命名為尿激酶(urokinase，UK)。UK是由腎細(xì)胞產(chǎn)生的一種堿性蛋白酶，為纖維蛋白溶酶原激活劑。uK主要存在于人及哺乳動(dòng)物尿中，人尿平均含量約56IUml。天然UK的分子量為5400

22、0，絲氨酸和組氨酸是UK活性中心的必需氨基酸。,二、尿激酶的制備工藝流程,藥用UK主要從新鮮人尿中提取，目前主要有三種方法。其一是發(fā)泡法，即高速攪拌使尿液發(fā)泡，然后泡沫液化，加入硫酸銨，使UK沉淀得粗品；其二是沉淀法，于尿液中加入沉淀劑(常用鞣酸、苯甲酸、重金屬離子等)使UK沉淀，其三是最常用的吸附劑法，即選擇適當(dāng)?shù)奈絼┯羞x擇性地吸附UK，然后分離純化。吸附劑種類較多，如硅膠、硅藻土、734樹脂、活性炭等。,三、尿激酶的活性測定,中國藥典規(guī)定：本品系從新鮮人尿中提取的一種能激活纖維蛋白溶酶原的酶。它是由高分子量54000和低分子量33000組成的混合物，HUK含量不得小于90，每1mg蛋白中

23、UK活力不得少于100000單位。,UK的效價(jià)測定方法有氣泡上升法、小球下落法、纖維素平板法、底物合成法和HPLC法等。現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)采用氣泡上升法和氮測定法檢測比活力。,四、尿激酶的藥理作用與臨床應(yīng)用,UK屬蛋白分解酶，在體內(nèi)可作為酶原激活劑，活化血纖溶酶原成為血纖溶酶。UK對(duì)血纖維蛋白，血纖維蛋白原，凝血因子V、等均有溶解作用，因而具有溶血栓、抗凝血的功能，故是一種高效的溶血栓劑。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)UK有明顯降低血壓的作用。,四、尿激酶的藥理作用與臨床應(yīng)用,目前，臨床上已將UK用于治療各種血栓的形成、血栓梗塞性疾病，如腦血栓、中央視網(wǎng)膜血管閉塞癥、急性心肌梗死、肺栓塞、四肢及周圍動(dòng)脈血栓癥

24、等，還用于動(dòng)靜脈交支血栓以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。,第八節(jié) 微生物酶的開發(fā),應(yīng)用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)：,(1)微生物生長繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來生產(chǎn)酶產(chǎn)品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地?cái)U(kuò)大，能夠滿足迅速擴(kuò)張的市場需求。 (2)微生物種類繁多，它們散布于整個(gè)地球的各個(gè)角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。 (3)這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 (4)特別是當(dāng)基因工程介入時(shí)，動(dòng)植物細(xì)胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細(xì)胞獲得。,微生物酶的開發(fā),因此，有計(jì)劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，通?？梢垣@得能夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的適當(dāng)細(xì)胞

25、。,微生物酶開發(fā)的一般程序,(一) 樣品的采集 采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù)量。,微生物酶開發(fā)的一般程序,(二) 菌種的分離 培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。,微生物酶開發(fā)的一般程序,(三) 菌種的初篩 (1)用簡單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩； (2)在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化分離。,微生物酶開發(fā)的一般程序,(四) 菌種的復(fù)篩 初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的目的是在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。 酶活的測定方法的建立尤其重要。,微生物酶開發(fā)的一般程序,(五) 對(duì)復(fù)篩獲得菌株

26、的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易變化和退化； (3)不易感染噬菌體； (4)微生物產(chǎn)酶量高； (5)酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，而且最好是胞外酶； (6)產(chǎn)生的酶便于分離和提取，得率高； (7)微生物培養(yǎng)營養(yǎng)要求低。,微生物酶開發(fā)的一般程序,(六) 最佳產(chǎn)酶條件的初步確定 (1)培養(yǎng)方式的確定； (2)最佳培養(yǎng)條件組合； (3)微生物產(chǎn)酶的特性(胞內(nèi)酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的時(shí)間順序；,微生物酶開發(fā)的一般程序,(七) 微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高 (1)獲得高產(chǎn)菌種的突變體； (2)利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來提高微生物的酶產(chǎn)量； (3)運(yùn)用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的

27、目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對(duì)生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)性的微生物細(xì)胞之內(nèi)，使其高效表達(dá)；,微生物酶開發(fā)的一般程序,(八) 微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提； (2)酶的精制。,微生物酶開發(fā)的一般程序,(九) 微生物產(chǎn)酶菌種的保藏 (1)斜面； (2)沙土管； (3)冷凍。,第五章 酶的人工模擬,第一節(jié) 模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略,一、模擬酶的概念 模擬酶又稱人工酶或酶模型，它是生物有機(jī)化學(xué)的一個(gè)分支。 模擬酶是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機(jī)理和立體化學(xué)等特性的一門科學(xué)。 可見，模擬酶是從分子水平上模擬生物功能的一門邊緣科學(xué)。,二、模擬酶的理論基礎(chǔ),1模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ)

28、酶的催化機(jī)制：酶先與底物結(jié)合，進(jìn)而選擇性穩(wěn)定某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能從而加快反應(yīng)速度。 設(shè)計(jì)模擬酶一方面要基于酶的作用機(jī)制，另一方面則基于對(duì)簡化的人工體系中識(shí)別、結(jié)合和催化的研究。要想得到一個(gè)真正有效的模擬酶，這兩方面就必須統(tǒng)一結(jié)合。 在設(shè)計(jì)模擬酶時(shí)除具備催化基團(tuán)之外還要考慮到與底物定向結(jié)合的能力。,二、模擬酶的理論基礎(chǔ),2. 超分子化學(xué) （1）“主客體”化學(xué) Cram把主體與客體通過配位鍵或其他次級(jí)鎂形成穩(wěn)定復(fù)合物的化學(xué)領(lǐng)域稱為“主客體”化學(xué)，主客體化學(xué)的基本意義來源于酶和底物的相互作用，體現(xiàn)為主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)，這種主客體互補(bǔ)與酶和它所識(shí)別的底物結(jié)合情

29、況近似。,（2）超分子化學(xué) 超分子的形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，如靜電作用、氫鍵和范德華力等。當(dāng)接受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合成穩(wěn)定的，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實(shí)體，即形成了“超分子”，它兼具分子識(shí)別、催化和選擇性輸出的功能。,主客體化學(xué)和超分子化學(xué)已成為酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)，是人工模擬酶研究的重要理論武器。,在設(shè)計(jì)模擬酶之前應(yīng)當(dāng)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)有深入的了解； 酶活性中心底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)； 酶的專一性及其同底物結(jié)合的方式與能力； 反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及各中間物的知識(shí)。,設(shè)計(jì)人工酶模型應(yīng)考慮如下因素： （1）非共價(jià)鍵相互作用； （2）反應(yīng)定向發(fā)生； （3）模型應(yīng)具有足夠的水溶

30、性，并在接近生理?xiàng)l件下保持其催化活性。,第二節(jié) 模擬酶的分類,根據(jù)Kirby分類法，模擬酶可分為： 單純酶模型，即以化學(xué)方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性； 機(jī)理酶模型，即通過對(duì)酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合和過渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識(shí)，來指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和合成； 單純合成的酶樣化合物，即一些化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡單分子。,按照模擬酶的屬性，模擬酶可分為： 主客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等； 膠束酶模型； 肽酶； 抗體酶； 分子印跡酶模型； 半合成酶等； 近年來又出現(xiàn)了雜化酶和進(jìn)化酶。,一、主客體酶模型,（一）環(huán)糊精酶模型： 環(huán)糊精(cyclodextrin，簡

31、稱CD)是由多個(gè)D葡萄糖以1，4糖苷鍵結(jié)合而成的一類環(huán)狀低聚糖，CD分子外側(cè)是親水的，其羥基可與多種客體形成氫鍵，其內(nèi)側(cè)是C3，C5上的氫原子和糖苷氧原子組成的空腔，故具有疏水性，因而能包結(jié)多種客體分子，很類似酶對(duì)底物的識(shí)別。,環(huán)糊精作為酶模型,利用環(huán)糊精為酶模型已對(duì)多種酶的催化作用進(jìn)行了模擬。在水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)氨酶、氧化還原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和經(jīng)羥醛縮合酶等方面都取得了很大的進(jìn)展。,合成的主客體酶模型,(二) 合成的主客體酶模型 用合成的冠醚、穴醚、環(huán)番、環(huán)芳烴等大環(huán)多齒配體用來構(gòu)筑酶模型。,二、膠束模擬酶,膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境(類似于酶的結(jié)合部位)，可以對(duì)底物束縛。如果

32、將催化基團(tuán)如咪唑、硫醇、羥基和一些輔酶共價(jià)或非共價(jià)地連接或吸附在膠束上，就有可能提供“活性中心”部位，使膠束成為具有酶活力或部分酶活力的膠束模擬酶。,模擬水解酶的膠束酶模型：,組氨酸的咪唑基常常是水解酶的活性中心必需的催化基團(tuán)。如將表面活性劑分子上連接上組氨酸殘基或咪唑基團(tuán)上，就有可能形成模擬水解酶的膠束。,單分子膠束酶模型,將表面活性劑利用化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)在一起，制備出單分子膠束酶模型，這種酶模型比一般膠束酶優(yōu)越，它既具備酶的疏水特性，同時(shí)又可以使催化基團(tuán)引人疏水空腔，催化效率提高了105倍。,三、肽酶,模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。,四、半合成酶,半合成酶是以天然蛋白質(zhì)或酶

33、為母體，用化學(xué)或生物學(xué)方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，或改變其結(jié)構(gòu)從而形成一種新的“人工酶”。 如將枯草桿菌蛋白酶活性部位的絲織酸(Ser)殘基，經(jīng)苯甲基磺酰氟特異性活化后，再用巰基化合物取代，將絲氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。雖然產(chǎn)生的巰基化枯草桿菌蛋白酶對(duì)肽或酯沒有水解活力，但能水解高度活化的底物(如硝基苯酯等)。,第三節(jié) 印 跡 酶,一、分子印跡技術(shù)概述 如果以一種分子充當(dāng)模板，其周圍用聚合物交聯(lián)，當(dāng)模板分子除去后，此聚合物就留下了與此分子相匹配的空穴。如果構(gòu)建合適，這種聚合物就橡“鎖”一樣對(duì)鑰匙具有選擇性識(shí)別作用，這種技術(shù)被稱為分子印跡。,分子印跡技術(shù),所謂分子印跡是制備對(duì)某一化合物具有選擇性

34、的聚合物的過程。這個(gè)化合物叫印跡分子，也叫做模板分子。 此技術(shù)包括如下內(nèi)容： 選定印跡分子和功能單體，使二者發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)； 在印跡分子單體復(fù)合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)；用抽提法從聚合物中除掉印跡分子。 結(jié)果，形成的聚合物內(nèi)保留有與印跡分子的形狀、大小完全一樣的孔穴。該聚合物能以高選擇性重新結(jié)合印跡分子。,分子印跡聚合物的制備方法：,分子印跡聚合物的制備方法： 選定印跡分子和單體，讓他們之間充分作用； 在印跡分子周圍發(fā)生聚合反應(yīng)； 將印跡分子從聚合物中抽提出去。 于是，此聚合物就產(chǎn)生了恰似印跡分子的空間，并對(duì)印跡分子產(chǎn)生識(shí)別能力。,分子印跡分子,可用于分子印跡的分子很廣泛(如藥物、氨基酸、碳水化合物、

35、核酸、激素、輔酶等)，它們均已成功地用于分子印跡的制備中。 分子印跡聚合中應(yīng)用最廣泛的聚合單體是羧酸類(如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸)、磺酸類以及雜環(huán)弱減類(如乙烯基吡啶、乙烯基咪唑)，其中最常用的體系為聚丙烯酸和聚丙烯酞胺體系。若要產(chǎn)生對(duì)金屬的配合作用則應(yīng)用氨基二乙酸衍生物。,二、分子印跡酶,通過分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類似于酶的活性中心的空腔，對(duì)底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，更重要的是利用此技術(shù)可以在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán)并與底物定向排列。,1. 印跡底物及其類似物,如Mosbach等應(yīng)用分子印跡法制備具有催化二肽合成能力的分子印跡酶。所合成的二肽為Z-L-天冬氨酸與L苯丙氨酸甲酯縮

36、合產(chǎn)物，它們分別以底物混合物(ZL天冬氨酸與L苯丙氨酸為1：1混合)以及產(chǎn)物二肽為印跡分子，以甲基丙烯酸甲酯為聚合單體，二亞乙基甲基丙烯酸甲酯為交聯(lián)劑，經(jīng)聚合產(chǎn)生了具有催化二肽合成能力的二肽合成酶。研究表明以產(chǎn)物為印跡分子的印跡聚合物表現(xiàn)出最高的酶催化效率，在反應(yīng)進(jìn)行48h后，其二肽產(chǎn)率達(dá)到63而以反應(yīng)物為印跡分子的印跡聚合物催化相同的反應(yīng)時(shí)二肽產(chǎn)率卻較低。,2印跡過渡態(tài)類似物,用過渡態(tài)類似物作印跡分子制備的印跡聚合物也能結(jié)合反應(yīng)過渡態(tài)，降低反應(yīng)活化能，從而加速反應(yīng)。 如用對(duì)硝基苯乙酸酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)類似物對(duì)硝基苯甲基磷酸酯作印跡分子制備聚合物，制得的MIP證明能優(yōu)先結(jié)合過渡態(tài)類似物，并能加

37、速對(duì)硝基苯乙酸酯水解成對(duì)硝基酚和乙酸。,第四節(jié) 抗 體 酶,一、抗體酶概述： 催化抗體是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，因此，催化抗體也叫抗體酶。,酶和抗體的本質(zhì)差別在于：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化性物質(zhì)而抗體是和基態(tài)分子結(jié)合的催化性物質(zhì)。 抗體酶的發(fā)現(xiàn)不僅提供了研究生物催化過程的新途徑，而且能為生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)提供具有高度特異性的人工生物催化劑，并可以根據(jù)需要使人們獲得具有某些不能被酶催化或較難催化的化學(xué)反應(yīng)催化劑。,二、抗體酶的制備方法,迄今，大多數(shù)抗體酶是通過理論設(shè)計(jì)合適的與反應(yīng)過渡態(tài)類似的小分于作

38、為半抗原，然后讓動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體來獲得的。由于以反應(yīng)的過渡態(tài)類似物為半抗原誘導(dǎo)的抗體在幾何形狀和電學(xué)性質(zhì)上與反應(yīng)過渡態(tài)互補(bǔ)，因而穩(wěn)定了過渡態(tài)，從而加速反應(yīng)。,1穩(wěn)定過渡態(tài)法：,以Pauling的穩(wěn)定過渡態(tài)理論為指導(dǎo)，即利用反應(yīng)的過渡態(tài)類似物作為半抗原產(chǎn)生抗體酶。 Shultz小組利用與底物扭曲構(gòu)象相似的扭曲卟啉作半抗原制備的抗體可催化卟啉金屬螯合反應(yīng)。亞鐵螯合酶是血紅素生物合成途徑中的末端酶，可催化亞鐵離子插入原卟啉的生物合成。N甲基原卟啉由于內(nèi)部甲基取代而呈扭曲結(jié)構(gòu)，它是此酶的有效抑制劑，也與酶催化的卟啉金屬螯合反應(yīng)的過渡態(tài)類似。由于甲基卟啉的抗體可催化平面結(jié)構(gòu)原卟啉的金屬螯

39、合，這就為該反應(yīng)過渡態(tài)扭曲結(jié)構(gòu)的作用提供了證據(jù)。,2抗體與半抗原互補(bǔ)法,抗體常含有與配體功能互補(bǔ)的特殊功能基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)帶正電的配體常能誘導(dǎo)出結(jié)合部位帶負(fù)電殘基的配體，反之亦然。抗體與半抗原之間的電荷互補(bǔ)對(duì)抗體所具有的高親和力以及選擇性識(shí)別能力起著關(guān)鍵作用。,Shokat等利用抗體與半抗原之間的電荷互補(bǔ)性，制備了針對(duì)帶正電半抗原的抗體，結(jié)果在抗體結(jié)合部位上產(chǎn)生帶負(fù)電的羧基，可作為一般堿基催化消除反應(yīng)。,三、抗體酶的應(yīng)用,1 抗體酶在有機(jī)合成中的應(yīng)用: 各類精細(xì)化工產(chǎn)品和合成材料的工業(yè)生產(chǎn)需要具有精確底物專一性和立體專一性的催化劑，而這正是催化抗體的突出特點(diǎn)。特別是那些天然酶不能催化的反應(yīng)，可通過

40、設(shè)計(jì)定做抗體酶來彌補(bǔ)天然酶的不足。,2 . 用于闡明化學(xué)反應(yīng)機(jī)制,3. 抗體在醫(yī)療上的應(yīng)用: Landry等用可卡因降解的過渡態(tài)類似物磷酸單酯產(chǎn)生的單克隆抗體3B9催化可卡因降解，此抗體酶的催化活性比血液中分解可卡因的丁酰膽堿酯酶要高，水解后的可卡因片斷失去了刺激功能，因此，用人工抗體酶的被動(dòng)免疫也許能提供阻斷可卡因上癮的治療從而達(dá)到戒毒的目的。,四、抗體酶的研究進(jìn)展,1反應(yīng)性免疫 2抗體酶的化學(xué)篩選 3. 抗體酶催化的化學(xué)轉(zhuǎn)化,第六章 酶制劑的應(yīng)用,第一節(jié) 概論,1.工業(yè)用酶制劑的市場和發(fā)展 2.我國酶制劑應(yīng)用方面的現(xiàn)狀和問題 3.工業(yè)酶制劑的來源與特點(diǎn) 4.選擇使用酶制劑時(shí)應(yīng)考慮的因素 5

41、.酶制劑產(chǎn)品的開發(fā)熱點(diǎn),我國酶制劑應(yīng)用方面的現(xiàn)狀和問題,1.酶制劑企業(yè)規(guī)模太小； 2.酶制劑品種少，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)極不合理； 3.對(duì)酶制劑的開發(fā)熱情不高，主要依賴于各大學(xué)及科研機(jī)構(gòu)，經(jīng)費(fèi)投入不足； 4.酶制劑生產(chǎn)成本太高； 5.生產(chǎn)裝備落后； 6.酶制劑應(yīng)用領(lǐng)域十分狹窄，主要集中于洗滌劑、淀粉加工、乙醇和酒類生產(chǎn)。,工業(yè)酶制劑的來源與特點(diǎn),工業(yè)酶制劑主要來源于動(dòng)物、植物和微生物，尤其是微生物，因微生物繁殖速度快；種類繁多，品種齊全；培養(yǎng)方法簡單，易于大批量生產(chǎn)。 工業(yè)酶制劑的特點(diǎn)：一般而言，含雜蛋白的酶制劑比純品穩(wěn)定，干燥品比液體制劑穩(wěn)定。酶是通過催化活性而不是一般質(zhì)量來識(shí)別和出售的。,選擇使用酶制

42、劑時(shí)應(yīng)考慮的因素,（1）底物特異性 （2）pH （3）溫度 （4）激活劑和抑制劑 （5）價(jià)格因素,酶制劑產(chǎn)品的開發(fā)熱點(diǎn),（1）食品加工用酶， （2）飼料用酶，特別是植酸酶， （3）紡織用酶 （4）洗滌劑用酶 （5）臨床診斷用酶、治療用酶、化妝品用 酶,第二節(jié) 酶在食品加工方面的應(yīng)用,一、酶法生產(chǎn)葡萄糖,國內(nèi)外萄萄糖的生產(chǎn)大都采用酶法。酶法生產(chǎn)葡萄糖是以淀粉為原料，先經(jīng)淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成葡萄糖。,淀粉的液化,淀粉先加水配制成濃度為30一40的淀粉漿，pH值一般調(diào)至6.065，添加一定量的淀粉酶后，在8590的溫度下保溫45min左右，使淀粉液化成糊精。液化反應(yīng)一般以碘反應(yīng)顏色正

43、好消失時(shí)為終點(diǎn)。,淀粉液的糖化,液化完成后，將液化淀粉液冷卻至5560，pH調(diào)至4.55.0，加入適量的糖化酶，保溫糖化48h左右，使糊精轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰?葡萄糖生產(chǎn)應(yīng)注意的問題,所采用的淀粉酶和糖化酶都要求達(dá)到一定的純度。尤其是糖化酶中應(yīng)不含或盡量少含葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶。因?yàn)槠咸烟擒辙D(zhuǎn)移酶會(huì)催化葡萄糖生成異麥芽糖等雜質(zhì)，會(huì)嚴(yán)重影響葡萄糖的收率。 去除葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的最簡單的方法之一是將糖化酶配成酶液后，加酸調(diào)節(jié)pH值至2.02.5，室溫下靜置一段時(shí)間，可以選擇性地破壞葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶。,二、果葡糖漿的生產(chǎn),果葡糖漿是由葡萄糖異構(gòu)酶催化葡萄糖異構(gòu)化生成部分果糖而得到的葡萄糖與果糖的混合糖漿。,方 法,

44、將精制葡萄糖溶液調(diào)節(jié)pH為6.57.0，加入0.01mol/L的硫酸鎂，在6070的溫度條件下，由葡萄糖異構(gòu)酶催化生成果葡糖漿。異構(gòu)化率一般為4245。 鎂離子和鈷離子是葡萄糖異構(gòu)酶的激活劑，所以葡萄糖液中需加入0.01mol/L左右的硫酸鎂。,三、啤酒發(fā)酵,在啤酒生產(chǎn)過程中，制漿和調(diào)理兩個(gè)階段需使用酶制劑。 在浸泡麥芽漿時(shí)，需使用蛋白酶、 淀粉酶和糖化酶。 在發(fā)酵完畢后，啤酒需要進(jìn)一步酶處理。木瓜蛋白酶、波蘿蛋白酶可以降解使啤酒渾濁的蛋白質(zhì)組分，延長啤酒的儲(chǔ)存期。,四、在蛋白制品加工方面的應(yīng)用,酶在蛋白制品加工中的主要用途是改善組織，嫩化肉類，轉(zhuǎn)化廢棄蛋白質(zhì)成為供人類使用或作為飼料的蛋白質(zhì)濃

45、縮液，因而可以增加蛋白質(zhì)的價(jià)值和可利用性。 用木瓜蛋白水解酶制成嫩肉粉，使肉食嫩滑可口。 用蛋白酶生成明膠。 用溶菌酶處理肉類，則微生物不能繁殖，因此肉類制品可以保鮮和防腐等。 葡萄糖氧化酶在食品工業(yè)上主要用來去糖和脫氧，保持食品的色、香、味，延長保存時(shí)間。,五、在水果、蔬菜加工方面的應(yīng)用,用果膠酶處理潰碎果實(shí)，可加速果汁過濾，促進(jìn)澄清。主要依靠降低粘度使懸濁物質(zhì)失去保護(hù)膠體而沉降。 葡萄糖氧化酶可除去果汁、飲料、罐頭食品和干燥果蔬制品中的氧氣，防止產(chǎn)品氧化變質(zhì)，防止微生物生長，以延長食品保存期，也可用葡萄糖氧化酶保鮮。 溶菌酶可防止細(xì)菌污染，起食品保鮮作用等。,六、乳品工業(yè),凝乳酶制造干酪；

46、 過氧化氫酶牛奶消毒； 溶菌酶添加在嬰兒奶粉；人奶與牛奶的區(qū)別之一在于溶菌酶含量的不同，奶粉中添加卵清溶菌酶可防止嬰兒腸道感染。 乳糖酶分解乳糖； 脂肪酶黃油增香。,七、肉類和魚類加工,酶在這方面的兩個(gè)用途是改善組織、激化肉類，及轉(zhuǎn)化廢棄蛋白質(zhì)使其成為供人類食用或作為飼料的蛋白質(zhì)濃縮物。 蛋白酶還用于生產(chǎn)牛肉汁、雞汁等來提高產(chǎn)品收率。,八、蛋品加工,用葡萄糖氧化酶去除蛋品中的微量葡萄糖，是酶在蛋品加工中的一項(xiàng)重要用途。 葡萄糖氧化酶的作用是催化葡萄糖脫氫，氧化成為葡萄糖酸同時(shí)產(chǎn)生過氧化氫，后者被共存的過氧化氫酶催化分解為水和氧，一分子葡萄糖氧化酶在1min內(nèi)可催化34000個(gè)葡萄糖分子。,第三

47、節(jié) 酶在輕工業(yè)方面的應(yīng)用,酶在輕工業(yè)方面的應(yīng)用十分廣泛。 概括起來主要有3個(gè)方面的用途。 (1) 用酶進(jìn)行原料處理， (2) 用酶生產(chǎn)各種產(chǎn)品， (3) 用酶增強(qiáng)產(chǎn)品的使用效果。,一、酶在原料處理方面的應(yīng)用,(1) 發(fā)酵原料的處理：發(fā)酵工業(yè)大多數(shù)以淀粉為主要原料。有些微生物由于本身缺乏淀粉酶系，無法直接利用淀粉。故此必須先經(jīng)過原料處理，將淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的單糖或二糖，才能利用。例如，酒精、酒類、甘油、乳酸、氨基酸、核苷酸等發(fā)酵所使用的酵母或細(xì)菌等微生物，一般都不能直接利用淀粉進(jìn)行發(fā)酵。 淀粉原料的處理，一般是采用淀粉酶進(jìn)行液化，然后再經(jīng)糖化酶進(jìn)行糖化，將淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰?(2) 紡織原料的處

48、理,在紡織工業(yè)中，為了增強(qiáng)纖維的強(qiáng)度和光滑性，便于紡織，需要先行上漿。將淀粉用淀粉酶處理一段時(shí)間，使粘度達(dá)到一定程度就可用作上漿的漿料。,(3)造紙?jiān)系闹茲{,造紙?jiān)系睦w維中含有大量木質(zhì)素，若不除去則會(huì)嚴(yán)重影響紙的質(zhì)量。用木質(zhì)素酶可以使木質(zhì)素水解而除去，不但可提高紙的質(zhì)量，而且使環(huán)境污染程度大為減輕。,(4) 生絲的脫膠處理,天然蠶絲的主要成分是不溶于水的有光澤的絲蛋白。采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或微生物蛋白酶處理，可在比較溫和的條件下催化絲膠蛋白水解，進(jìn)行生絲脫膠。,二、輕工產(chǎn)品方面的應(yīng)用,1. 酶法生產(chǎn)甜味劑： 在青桔柑中合有10一20的橙皮苷，經(jīng)抽提后用黑曲霉桔皮苷酶水解除去分子中的鼠李

49、糖，在堿性下水解和還原，可得到一種甜味強(qiáng)烈的橙皮素葡萄糖苷二氫查耳酮。它的甜度是蔗糖的70一100倍，是一種安全、低熱的甜味劑，可是它的溶解度很低，僅0.1，故無實(shí)用價(jià)值，若將此物與淀粉溶液混合，利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的偶聯(lián)反應(yīng)使其葡萄糖分子接上兩個(gè)葡萄糖分子于是使溶解度提高10倍而不影響甜度。,二、輕工產(chǎn)品方面的應(yīng)用,2酶法生產(chǎn)L氨基酸 3酶法生產(chǎn)核苷酸 4. 酶法生產(chǎn)有機(jī)酸 5丙烯酰胺的生產(chǎn) 6鄰苯二酚的生物合成 7用于明膠、膠原纖維生產(chǎn),三、加酶增加產(chǎn)品的使用效果,1加酶洗滌劑: 洗滌用的酶制劑需要滿足下列條件：堿性條件(pH 910)下能夠有效洗滌；表面活性劑存在下，很少失活：在熒光染料、漂白劑、香料等洗滌劑輔助成分存在下不失活；在洗滌溫度下能有效地發(fā)揮作用。,三、加酶增加產(chǎn)品的使用效果,2加酶清洗劑 3加酶牙膏、牙粉和漱口水 4加酶飼料 5加酶護(hù)膚品,酶工程復(fù)習(xí)題,一、名詞解釋,1、酶的活性中心： 2、Km： 3、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)： 4、競爭性抑制： 5、人工模擬酶： 6、測糖試紙：,7、親和標(biāo)記： 8、變構(gòu)調(diào)節(jié)： 9、同工酶： 10、固定化酶： 11、化學(xué)修飾： 12、抗體酶：,二、填空題：,1、酶工程主要指_，由四個(gè)