沈陽藥科大學(xué)生物化學(xué)課件-第14章基因工程

1、基因重組和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第 十 四 章,目 錄,第 一 節(jié)DNA的重組 DNA Recombination,DNA重組,接合作用 (conjugation),轉(zhuǎn)化作用 (transformation),轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction),轉(zhuǎn) 座 (transposition),同源重組 (homologous recombination),位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination),發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱

2、基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。,以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。,一、同源重組,Holliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟,兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊 一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體 通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：,片段重組體 （見模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。,拼接重組體（見模

3、型圖右邊產(chǎn)物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。,Holiday中間體,目 錄,片段重組體,拼接重組體,目 錄,二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,（一）接合作用,當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。,可接合質(zhì)粒如 F 因子(F factor),質(zhì)粒 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,（二）轉(zhuǎn)化作用,通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。,例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一

4、細(xì)菌攝取。,目 錄,（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。,噬菌體的生活史,溶菌生長(zhǎng)途徑 (lysis pathway) 溶源菌生長(zhǎng)途徑 (lysogenic pathway),例,目 錄,目 錄,三、位點(diǎn)特異重組 位點(diǎn)特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。,例 （一）噬菌體DNA的整合 噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地

5、識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。,例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組,沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變,hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。,沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變,例（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。,輕鏈的基因片段

6、：,重鏈的基因片段：,重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。,V,J,分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng),單鏈切開 轉(zhuǎn)移核苷酸 修復(fù)、連接,免疫球蛋白基因重排過程,目 錄,四、轉(zhuǎn)座重組,由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。,插入序列(insertion s

7、equences, IS)組成： 二個(gè)分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重復(fù)序列 一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因,發(fā)生形式： 保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition) 復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition),（一）插入序列轉(zhuǎn)座,插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座,目 錄,轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。 轉(zhuǎn)座子組成：反向重復(fù)序列 轉(zhuǎn)座酶編碼基因 抗生素抗性等有用的基因,（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座,由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座,目 錄,第 二 節(jié) 重組DNA技術(shù),DNA Re

8、combination Technique,重組DNA技術(shù)的發(fā)展史,年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn) 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1973年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子 1977年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。 1980年 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠 1997年 英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉,相關(guān)概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因載體 基本原理 重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系,本節(jié)主要內(nèi)容,一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念,克隆(clone) 來自同一始祖

9、的相同副本或拷貝的集合。,獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。,（一） DNA克隆,技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 細(xì)胞克隆 個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）,DNA克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。,生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、

10、酶工程、細(xì)胞工程等,目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）,基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。,（二）工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶,重組DNA技術(shù)中常用的工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶,定義 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識(shí)別DNA的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。,+,Bam H,作用 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系

11、統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身DNA。,分類 、 （基因工程技術(shù)中常用型）,第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個(gè)字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第三種酶,類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功異源酶 來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割

12、DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,（三）目的基因,cDNA (complementary DNA) 基因組DNA (genomic DNA),（四）基因載體,定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。,常用載體 質(zhì)粒DNA 噬菌體DNA 病毒DNA,克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。 表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的

13、載體稱為表達(dá)載體。,載體的選擇標(biāo)準(zhǔn),能自主復(fù)制； 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源DNA。,1. 質(zhì)粒 (plasmid),特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。,目 錄,噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）,2. 噬菌體(phage),M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,3. 粘性質(zhì)粒(cosmid),酵母人工染色體 (yeast

14、artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動(dòng)物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）,其他,二、重組DNA技術(shù)基本原理,以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程,目 錄,（一）目的基因的獲取,1. 化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 2.基因組DNA文庫(genomic DNA library) 3. cDNA文庫(cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR

15、) （見第22章）,* 化學(xué)合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列,組織或細(xì)胞染色體DNA,基因片斷,克隆載體,重組DNA分子,含重組分子的轉(zhuǎn)化菌,限制性內(nèi)切酶,受體菌,基因組DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合,* 從基因組DNA文庫獲取目的基因,目 錄,目 錄,目 錄,（三）外源基因與載體的連接,1. 粘性末端連接 方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接 配伍末端連接 非配伍末端連接,（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建,Bam H切割反應(yīng),T4 DNA連接酶 15C,同一限制酶切位點(diǎn)連接,目 錄,不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）

16、的連接,Eco R切割位點(diǎn),Bg l切割位點(diǎn),配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。,目 錄,2. 平端連接 適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端,目 錄,3. 同聚物加尾連接 在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。,載體DNA,目的基因,限制酶或機(jī)械剪切,限制酶,目 錄,4. 人工接頭(linker)連接 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。,人工接頭及其應(yīng)用,目 錄,受體菌條件 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)(compete

17、nt),導(dǎo)入方式 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection),（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌,（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等,(插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇,目 錄,組氨酸缺陷 型大腸桿菌,無組氨酸 的培養(yǎng)基,酵母咪唑甘油磷 酸脫水酶基因,促進(jìn)組氨酸合成,DNA,重組體,標(biāo)志補(bǔ)救,目 錄,互補(bǔ),目 錄, 互補(bǔ)的檢測(cè),目 錄,原位雜交,目 錄,Southern印

18、跡,目 錄,雞的肌球蛋白的克隆和檢出,目 錄,重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為,小 結(jié),重組DNA技術(shù)操作的主要步驟,目 錄,表達(dá)體系的建立 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,（六）克隆基因的表達(dá),1. 原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用） 標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn) E.coli表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基因組DNA 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì) 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白,大鼠胰島素原cDNA 的表達(dá)和分泌,目 錄,優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì),轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程,方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射,2. 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞,表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜,目 錄,目 錄,（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。,三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系,（二）生物制藥,重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品,目 錄,基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。,（三）基因診斷,