基因工程-2分子的雜交.ppt

1、第一章 基因工程的主要技術(shù)原理,第三節(jié) 核酸的分子雜交,1968年由華盛頓卡內(nèi)基學院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事發(fā)明的。 原理：帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。,1 核酸分子雜交技術(shù),彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，而形成的雙鏈分子。 DNA/DNA的雜交作用：檢測特定生物有機體之間的親源關(guān)系 DNA/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。,1.1雜種核酸分子,按其分子種類劃分 1） DNA雜交探針為DNA或RNA 2）

2、 RNA雜交探針為DNA或cDNA,1.2核酸雜交的類型,3） 蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體,按樣品制備過程劃分 1） 原位雜交(in situ hybridization) i. 原位菌落雜交 ii. 原位噬菌斑雜交 iii. 原位細胞雜交 iv. 原位組織塊雜交,1.2核酸雜交的類型,起源于標準的光學顯微鏡技術(shù)，這種技術(shù)曾被用來觀察細胞分裂期的染色體形態(tài)。 對于許多生物體來說，可以通過染色體的形狀或者不同方法的染色來區(qū)分。 原位雜交提供了一種通過在光學顯微鏡下觀察染色體的圖像，直接定位克隆基因的方法。,原位雜交,原位雜交的優(yōu)點 不僅能夠鑒定出基因存在于哪條染色體上， 還可以提供染色體上基因位置

3、的相關(guān)信息。,特點： 原位裂解細胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品， 可同時處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測某類細胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。,例如：菌落雜交 原位雜交之一，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。 目的：鑒定重組子。,檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù),經(jīng)固定劑處理的細胞被黏附在載玻片上，然后用核糖核酸酶和氫氧化鈉降解RNA，并使DNA分子變性，單個多聚核苷酸鏈之間的配對堿基被拆散，而且染色體也在一定程度上被拆開，暴露出通常被包裹在它們結(jié)構(gòu)

4、之中的DNA片段。 將一定量的被標記的基因摻入到制備好的染色體中。 標記基因和它的染色體拷貝雜交，最終在放射性自顯影中形成一個黑點。這個黑點的位置表示標記的基因在染色體上的位置。 盡管技術(shù)較難，但人們已經(jīng)利用原位雜交和放射性標記的探針，定位人類細胞遺傳圖譜上相當數(shù)量的基因。,原位細胞雜交,人們用熒光標記物替代放射性標記，將它連接到雜交探針上，探針與DNA分子雜交后，可以通過熒光顯微鏡直接觀察實驗結(jié)果。如果使用不同的熒光染料，可以同時探測兩個或更多的基因，通過熒光顏色間明顯的差異可以分辨出不同的雜交信號。 FISH經(jīng)常與已知正常染色體位置的探針一起使用，這項技術(shù)對于研究染色體已經(jīng)重新排列的細胞特

5、別有用。 染色體重新排列，例如染色體復(fù)制，或者是某一DNA片段從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一條染色體上，都能夠通過FISH相對較快地測定出來，比傳統(tǒng)的染色技術(shù)快很多。,熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH),2）斑點雜交(dot hybridization) 先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點在固體基質(zhì)上進行雜交，不能測定分子量大小。,先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有： i. 擴散法 ii. 毛細管法 iii. 電泳轉(zhuǎn)移法 iv. 真空轉(zhuǎn)移

6、法,3）轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交(blotting hybridization),它利用兩種探針與待測DNA結(jié)合，先將不帶標記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標記的探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測出0.2ng的DNA樣品,4) 夾心雜交法(sandwich hybridization),1) DNA和RNA的雜交 制備DNA或RNA樣品與固定基質(zhì)結(jié)合80真空固定預(yù)雜交加入標記探針雜交洗滌放射自顯影或顯色反應(yīng)。 2）蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定封閉劑封閉 一抗反應(yīng)洗滌二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)洗滌顯色反應(yīng)（EIA） 或

7、一抗放射標記物洗滌放射自顯影（RIA）,2 分子雜交的一般程序,2.1 雜交樣品膜的制備,1. 固定基質(zhì)的種類與特性 1）硝酸纖維素濾膜 (Nitrocellulose filter, NCF) 可與三類大分子的結(jié)合，其機理不清楚，可能為被動吸附。 NCF不能結(jié)合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（20,000）,優(yōu)點： i. 用于DNA，RNA雜交分析時結(jié)果可靠，靈敏，本底低。 ii. 用于蛋白質(zhì)分析時，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要預(yù)激活；易于操作 缺點： 結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)使用探針次數(shù)有限（2-3次）,硝酸纖維素濾膜NCF,硝酸纖維素膜 不能滯留小于150b

8、p的DNA片斷，不能同RNA結(jié)合。 應(yīng)用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對小片斷DNA的滯留能力。 RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。,2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙 最大特點：能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價結(jié)合，可用不同探針進行多次雜交分析。 該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時最好用放射性標記物。這類基質(zhì)對生物大分子是主動吸附。,i. 陽離子尼龍膜（如Zeta-prob，Zeta-bind等） i) 容量大, 蛋白質(zhì)可結(jié)合480g/cm2 ii) 可結(jié)合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白質(zhì)。 ii

9、i)韌性好 iv) 可用于電轉(zhuǎn)移 v) 可進行反復(fù)多次雜交試驗 vi) 廣泛的化學耐受性和可高溫消毒 *不能用于蛋白質(zhì)的直接染色 ii. 尼龍66 廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時陽離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時陰離子狀態(tài)。,3) 尼龍膜,4）離子膜 i. DEAE-纖維素紙(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制備回收) ii. CM-纖維素紙 (可用于堿性蛋白質(zhì)的結(jié)合),固定基質(zhì)的選擇依據(jù),1）強度，耐久性，操作簡便 2）高信噪比（低本底高信號） 3）生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性 4）重現(xiàn)性好,核酸雜交常用幾種膜的性能比較,尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： 1. 核酸印跡轉(zhuǎn)移：將

10、核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細管作用 2. 印跡雜交： 將具有核酸印跡的濾膜同帶有標記的DNA/RNA進行雜交。,1）原位雜交樣品膜的制備,2.2 各種雜交樣品膜的制備,2） 斑點雜交樣品膜的制備 制備樣品點樣固定（可用斑點雜交儀或直接點樣）,3）轉(zhuǎn)移雜交樣品膜的制備 i. 擴散法（Difusion blotting method ),ii. 毛細管法 (Capillary blotting method ),Southern 印跡,iii. 電轉(zhuǎn)移法 (electro blotting ),iv. 真空轉(zhuǎn)移法 (Vaccum bllotting ) 轉(zhuǎn)移速度與凝膠的速度和厚度成反比

11、，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時，真空法比毛細管法快13倍，其損失僅6%，而毛細管法損失率20%。,v. 各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 擴散法和毛細管法：操作簡便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴散法為70%，毛細管法80%）耗時多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對轉(zhuǎn)移條件要求較嚴。 iii) 真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。,i) 固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的SDS。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移 對于分子量較大的DNA片段，必須進行原位斷裂后再進行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最佳長度為1-2kb。,vi. 轉(zhuǎn)移的最佳條

12、件,其步驟是： 0.25M HCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）水洗0.5M NaOH/1M NaCl兩次，每次15分鐘轉(zhuǎn)移。 對于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一： 解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS。,1. 標記化合物的種類 1）放射性同位素標記物,125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標記；32P，3H，35S用于核酸標記， 其中32P和35S使用頻率高。 32P標記核苷酸的位或位，35S則是標記核苷酸的位.,2.3 標記探針的制備,2) 非放射性標記物 i. 生物素 分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個抗生物素蛋白可結(jié)

13、合4個生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，可大大提高其靈敏度。 生物素可以經(jīng)過化學法與不同的化合物結(jié)合形成標記化合物。,ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。 地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測上述標記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。,iii. 蛋白質(zhì)檢測標記物 i) 酶偶聯(lián)二抗（0.05ng） ii) 蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）。 可作用于大多數(shù)哺乳動物的IgG，靈敏度較低（5ng） iii) 免疫金（immunogold） 0.1-0.5ng,3) 兩類標記化合物的比較 i. 靈敏度

14、檢測蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。 檢測核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 穩(wěn)定性 酶法探針可在4保存一年，放射性標記需每次制備。 iii. 安全性 非放射性標記安全。 iv. 效率 非放射性標記所需時間短。,2. 標記探針的制備 1）鏈標記法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 隨機DNA引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P),iii. 反轉(zhuǎn)錄法 mRNA+dNTP(32P) cDNA（標記） iv. 轉(zhuǎn)錄法 含有待標記DNA片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P)RNA（標記） v. 引物延

15、伸法 含待標記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待標記DNA鏈,vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶, 無dNTP3-5外切酶活性加入dNTP和標記核苷酸新合成鏈（32P）,2) 末端標記 i. 5-末端標記 ss-和ds-DNA, RNA脫磷酸化反應(yīng) (CIP) T4DNA激酶(-32P )ATP ii. 3-末端標記 i) TdT加尾反應(yīng)，用于dsDNA,ii) 補齊反應(yīng),iii) T4 RNA連接酶反應(yīng) RNA-OH+*pNp（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi,3) 標記化合物的純化

16、i. 柱層析 利用Sephadex G-50，前峰-標記物，后峰-核苷酸 ii. 旋轉(zhuǎn)柱層析 快速，簡便, 可同時純化多個樣品。,2.4 分子雜交與結(jié)果檢測,1. 核酸雜交與結(jié)果檢測 1）預(yù)雜交： 預(yù)雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標記探針是cDNA或RNA，預(yù)雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合, 42 4-6h或過夜。 2）雜交：探針100變性，迅速冷卻，加入預(yù)雜交液中，42一天,3）洗滌： 2SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1SSC+0.1%SDS 65洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計算： T=4GC+2AT * 高強度與低強度雜交：若具高度特異性同源序

17、列，采用高強度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液的離子強度以及雜交和洗滌時的溫度。,4）放射自顯影或顯色反應(yīng) 使用放射性同位素標記物，采用放射自顯影。 若采用非放射性同位素標記物，則采用顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。主要有兩種酶： i. 辣根過氧化物酶: 可將3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。,ii. 堿性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應(yīng)中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶的作用位點。 iii. 兩種

18、酶偶聯(lián)物的比較 i) 堿性磷酸酶的靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)可持續(xù)幾個小時，其顯色結(jié)果可長期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應(yīng)僅能持續(xù)30分鐘。 5) 雜交結(jié)果,2. 蛋白質(zhì)的免疫分析 封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。,3 Southern DNA印跡雜交 由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的， 根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用，檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。,Southern 凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù),So

19、uthern DNA 印跡雜交之X光顯像圖片 水稻（Oryza sativa L.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,在進行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時， 1. 要將已轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤12小時； 2. 紫外線交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯(lián)。,4 Northern RNA印跡技術(shù)（

20、Northern blotting） 1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來， 將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與Southern DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做Northern RNA印跡技術(shù)（Northern blotting）。 而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質(zhì)之抗體進行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做Western 蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Western blotting）。,5 凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay） 又叫DNA遷移率變動實驗

21、（DNA mobility shift assay） 80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實驗方法。 原理： DNA與蛋白的結(jié)合導致了電泳時遷移率的降低。,不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 而且可以研究發(fā)生此中結(jié)合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標記競爭DNA）,可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 1. 用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子； 2. 在競爭DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。,凝膠阻滯實驗?zāi)芙沂驹隗w內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的有關(guān)信息，但無法確定兩者結(jié)合的準確部位，而DNase足跡實驗可以解決這個問題。,6 DNase足跡實驗 （footprinting assay） 是一類用于檢測與特定蛋