科研儀器學重點

1、名解：1、 流式細胞技術：就是利用流式細胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術。2.生物芯片（dna芯片或基因芯片）：dna雜交探針技術與半導體工業(yè)技術相的結(jié)合。將大量探針分子固定于支持物上后與帶熒光標記的dna樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量及序列信息。3.rcf（相對離心力）：在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是“g”。4.冷凍干燥：冷凍干燥（以下簡稱凍干）就是將含水物質(zhì)，先凍結(jié)成固態(tài)，而后使其中的水分從固態(tài)升華成氣態(tài)，以除去水分而保存物質(zhì)的方法。5.凍干曲線：將擱

2、板溫度與制品溫度隨時間的變化記錄下來，即可得到凍干曲線。比較典型的凍干曲線系將擱板升溫分為兩個階段，在大量升華時擱板溫度保持較低，根據(jù)實際情況，一般可控制在-10至+10之間。第二階段則根據(jù)制品性質(zhì)將擱板溫度適當調(diào)高，此法適用于其熔點較低的制品。 6.pcr技術：pcr技術又稱為聚合酶鏈式反應，其基本原理是根據(jù)細胞分裂中dna的半保留復制機理，體外合成目的dna片段的方法。pcr由變性退火延伸三個基本反應步驟構成。7.rt-pcr：指逆轉(zhuǎn)錄pcr, 是指從rna或mrna直接擴增獲得目的dna片段的過程。8.熒光定量 pcr：通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對pcr產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時

3、在線監(jiān)控反應過程，結(jié)合相應的軟件可以對結(jié)果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。9.分子篩層析技術: 凝膠顆粒內(nèi)部呈網(wǎng)孔狀結(jié)構，分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)難以進入凝膠顆粒內(nèi)部，主要從凝膠顆粒的間隙里通過，所受阻滯作用小，所以大分子蛋白質(zhì)遷移速度快，先流出凝膠 。分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)則容易進入凝膠顆粒內(nèi)部，所受阻滯作用大，所以小分子蛋白質(zhì)遷移速度慢，后流出凝膠，從而將分子質(zhì)量大小不同的蛋白質(zhì)分開。10.離子交換層析技術：蛋白質(zhì)是兩性分子，在一定的ph條件下帶有電荷，不同的蛋白質(zhì)所帶有電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。這樣，當?shù)鞍踪|(zhì)混合物流經(jīng)帶電凝膠時，電荷吸引作用小的蛋白質(zhì)

4、先流過，而電荷吸引作用大的蛋白質(zhì)后流過凝膠，從而把不同的蛋白質(zhì)分開。 11.吸附層析技術：由于不同的蛋白質(zhì)所含有的氨基酸的種類和數(shù)目不同，分子表面的極性氨基酸和非極性氨基酸的數(shù)目、分布區(qū)域不同，因此它與分子比表面積大的吸附劑間的相互作用力大小不同。根據(jù)此原理對蛋白質(zhì)進行分離純化。12.蛋白質(zhì)組學：蛋白質(zhì)組(proteome)是指基因組表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。13.雙向電泳技術：第一向 等電聚焦（ief）：等電聚焦是利用蛋白質(zhì)分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的，連續(xù)的，線形ph梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析。第二向 sds-page電泳： sds-page電泳是根據(jù)sds和還原試劑將蛋白質(zhì)分子解

5、聚后亞基的太小，在恒定的ph緩沖系統(tǒng)中的分離。經(jīng)過雙向電泳能將蛋白質(zhì)在一個二維平面分開。14.生物質(zhì)譜技術：質(zhì)譜技術是蛋白質(zhì)組學研究中最為廣泛使用的蛋白質(zhì)鑒定技術。其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定分子質(zhì)量。質(zhì)譜技術能從復雜的樣本中定性、定量分析蛋白質(zhì)，其靈敏度高，可達到fmol(10-15)乃至amol(10-18)，速度快，現(xiàn)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中主要的蛋白質(zhì)鑒定技術。15.肽質(zhì)量指紋圖譜maldi-tof-ms常用于蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemass finger printing，pmf)鑒定。pmf是指蛋白質(zhì)被酶切位點專一的蛋白

6、酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具特征性，所以稱為指紋圖譜(finger printing)。16.基質(zhì)輔助離子化技術：試樣溶解或懸浮于基質(zhì)中，激光束輻射到基質(zhì)和試樣分子上?；|(zhì)吸收激光束能量后汽化，部分試樣分子伴隨基質(zhì)的汽化而解吸?；|(zhì)吸收大部分激光能量，減少了試樣分子被激光能量破壞及過度電離成碎片離子。17.核酸分子雜交:把親源關系較近的，不同生物個體來源的變性dna或rna單鏈，經(jīng)退火處理形成dna-dna或dna-rna這一過程叫分子雜交。18.southern 印跡雜交原理:基因組dna經(jīng)限

7、制性內(nèi)切酶消化后進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠上dna經(jīng)變性后，轉(zhuǎn)印至尼龍膜上，用帶有標記（放射性，螢光）目的基因作探針與之雜交，經(jīng)放射自顯顯，檢測是否含有與探針互補的dna序列。19.northern印跡雜交:細胞或者組織的總rna進行瓊脂糖凝膠電泳，并將凝膠上rna轉(zhuǎn)印至尼龍膜上，用帶有標記（放射性，螢光）目的基因 或其互補rna作探針與之雜交，經(jīng)放射自顯影，檢測是否含有與探針互補的mrna序列。所以與southern blot， northern blot是mrna與互補的單鏈dna或 rna雜交。 20.western blot(蛋白質(zhì)印跡技術)的原理:首先將蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子

8、大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍膜或其他膜上，用抗體作為探針與之雜交，反應之后用放射自顯影或底物顯色來檢測是否與抗體特異性結(jié)合的抗原。 與dna和rna不同的是，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移方可完成，反應時用堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶標記或同位素標記第二抗體。 填空1 使用流式細胞儀檢測細胞周期、細胞dna、rna含量、總蛋白質(zhì)含量用（線性）放大器，檢測細胞表面抗原、膜受體分布（對數(shù)）放大器。2 影響dna測序的因素（模板的影響、循環(huán)測序反應條件、電泳的影響）。模板的影響：模板dna不純；定量不準；難測模板循環(huán)測序反應條件：引物的影響；富含gc的模板電泳的影響3 染色細胞核的染料：hoechst33

9、258（藍）、dapi（藍）、fitc(綠) 、propodium iodide（紅）、cy3（紅）4.細胞融合的方法（電融合、聚乙二融合醇、病毒融合）。5 激光共聚焦顯微鏡的原理是利用（一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光）的成像原理。6 細胞穿孔的方法（電穿孔、磷酸鈣沉淀法、激光鉆孔法、微射彈法）。7 酶標儀中的光學檢測方法（光度測定、熒光、時間分辨熒光、熒光偏振、化學發(fā)光）。8 dna測序的主要方法（新生鏈熒光標記、雙脫氧末端終止法）。9 用于提取純化生物大分子理化性質(zhì)的離心機（分析性離心機），用于實驗的（制備型離心機）。10流式細胞術前向散射（fsc，小角散射），大小與細

10、胞直徑成正比，細胞越大，fsc越大；側(cè)向散射（ssc，90散射），與細胞內(nèi)顆粒結(jié)構的質(zhì)量成正比，胞內(nèi)顆粒結(jié)構越復雜質(zhì)量越大，ssc越大。11.鈣離子熒光指示劑包括：indo-1；fura-2；fluo-3；quin-2。12.全自動dna測序儀主要包括電泳系統(tǒng)，激光器和熒光檢測系統(tǒng)。大致可分為（自動進樣區(qū)）（凝膠塊區(qū)）和（檢測區(qū)）等結(jié)構功能區(qū)。13. 全自動dna測序儀根據(jù)電泳方式的不同分為平板型電泳和毛細管電泳兩種儀器類型。14.dna測序過程包括：分離純化模板dna,dna模板定量分析，測序反應，測序反應后純化，on-line變性，毛細管電泳和檢測和數(shù)據(jù)分析。15dna測序過程中，用熒光標

11、記新生鏈時，分為多色標記法和單色標記法;根據(jù)標記部位不同，又分為熒光標記引物法和熒光標記終止底物法。 16、激光共聚焦由（顯微鏡光學系統(tǒng)）（激光光源）（掃描裝置）和（檢測系統(tǒng)）構成。17、常規(guī)pcr技術包括（變性）-（退火）-（延伸）三個基本反應步驟。18常規(guī)pcr反應體系由(緩沖液)(模板dna)(引物)(4種脫氧核糖核苷三磷酸)(taqdna聚合酶)和(mg2+)構成。19. 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小分離純化的方法有：透析、超過濾、分子篩層析、變性聚丙烯凝膠電泳等。20、根據(jù)蛋白質(zhì)分子帶電性不同分離純化的方法有：等電點沉淀、離子交換層析、等電聚焦電泳等。21、蛋白質(zhì)細分級方法：分子篩層析、離子交

12、換層析、親和層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向電泳、毛細胞電泳，等電聚焦電泳等。22蛋白質(zhì)粗分級方法：硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級沉淀、超速離心、等電點沉淀、透析、超濾等。23蛋白質(zhì)組研究的核心技術：（蛋白質(zhì)分離技術）（蛋白質(zhì)鑒定方法）（生物信息學技術）。24. 質(zhì)譜儀關鍵部件是（離子源）和（質(zhì)量分析器），其中（質(zhì)量分析器）決定著質(zhì)譜的準確度、靈敏度和分辨率等。25.核酸分子雜交探針標記有（同位素標記）和（非同位素標記）兩種。其中非同位素標記物有（生物素）（地高辛配體）（熒光素）等。簡答1 pcr（聚合酶鏈式反應）的原理。（了解）dna在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。通

13、過溫度變化控制dna的變性和復性，設計引物做啟動子，加入模板鏈、dna聚合酶、dntp，可完成特定基因的體外復制。2.流式細胞術的特點。1、實現(xiàn)對單列細胞的檢測2、實現(xiàn)高通量檢測3、多參數(shù)、多色熒光分析使細胞識別技術更精確4、可定性定量分析細胞5、分選特定功能，性狀的細胞3電穿孔儀與細胞融合儀的基本原理。（掌握）電穿孔儀：細胞膜基本上是一絕緣體，膜兩側(cè)浸在含離子的電解質(zhì)溶液中，在外加電場時，膜兩邊的電解質(zhì)離子極化，形成外加膜電位差。高壓電脈沖擊穿細胞膜后，磷脂雙分子層和細胞膜均可復原。細胞膜的復原與脂肪分子的排列和相互間引力有關，還與其他如膠體滲透作用、溶液離子作用和膜蛋白的影響等因素有關。細

14、胞融合儀：通過非均勻電場的電介質(zhì)電泳作用，建立細胞(原生質(zhì)體)間的緊密接觸，形成細胞串。再利用高壓脈沖的可逆擊穿效應使接觸區(qū)質(zhì)膜上形成微孔，胞質(zhì)通過微孔融合。4.流式細胞儀的構成模塊。（掌握）流動室與液流系統(tǒng)、光源與光學系統(tǒng)、信號收集與信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計算機與分析系統(tǒng) ，分選系統(tǒng)。5.熒光檢測酶標儀的主要模塊。1、一個激發(fā)光源（鹵素燈氙燈、激光）2、熒光色團 (染料)3、波長選擇元件：濾光片對或光柵(區(qū)分激發(fā)光和發(fā)射光）4、發(fā)射光檢測器 (光電倍增管，即pmt）6.超速離心機的主要使用注意事項。（了解）1離心前預冷轉(zhuǎn)子2超速離心時，液體一定要加滿離心管，避免離心管變形3離心后清潔離心機腔體和轉(zhuǎn)頭

15、，并擦干腔內(nèi)冷凝水，打開門，直至腔內(nèi)恢復常溫。7 簡述影響電穿孔儀和細胞融合儀的因素。（了解）1采用指數(shù)型衰減波優(yōu)于使用方形波2達到臨界電壓，否則無法擊穿細胞膜3對于細菌由于有外膜，臨界電壓需要加大12個數(shù)量級）8.分光光度計的理想光源條件：（掌握）理想光源的條件是：能提供連續(xù)的輻射；光強度足夠大；在整個光譜區(qū)內(nèi)光譜強度不隨波長有明顯變化；光譜范圍寬；使用壽命長，價格低。9.雙脫氧末端終止法原理：（必考） 其原理是利用dna的體外合成過程，但與普通pcr不同的是，雙脫氧鏈末端終止法測序反應中除有-脫氧核苷三磷酸（dntp）外，還加入2雙脫氧核苷三磷酸（2ddntp）。由于沒有oh.不能進行后續(xù)

16、反應，使正在延伸的dna鏈在此終止。由于存在ddntp與dntp的競爭，生成的反應產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段，通過電泳分離后可讀出新生dna鏈的序列。10.簡述熒光定量 pcr定量原理及計算方法反應最初，雖然產(chǎn)物是指數(shù)增長,但是熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加.當累積了足夠的擴增產(chǎn)物，可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時，這個循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即ct。由于ct值處于指數(shù)期內(nèi)，這時的反應成份不會抑制擴增反應進行，因此熒光定量pcr結(jié)果是可靠的，可以準確地反應體系中模板的初始量。如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距由等式“2n=稀釋倍數(shù)“決定； n為閾值線上擴增曲線之間的循環(huán)數(shù)（ct的差

17、值）11 熒光定量pcr的應用（1）實時監(jiān)測產(chǎn)物量，計算初始模板量（2）基礎研究的基因表達分析研究（3）臨床病原體檢測（病人體液中目標基因的檢測：病毒，寄生蟲，細菌；市場上有各種開發(fā)好的試劑盒）（4）食品衛(wèi)生檢疫（a.轉(zhuǎn)基因食品的檢疫：根據(jù)轉(zhuǎn)入基因的特異性區(qū)段設計探針b.食品中病原微生物的檢測）12 蛋白質(zhì)分離純化與鑒定的主要步驟 1、選擇實驗材料2、實驗材料的預處理 3、蛋白質(zhì)的提取 4、蛋白質(zhì)粗分級 5、蛋白質(zhì)細分級 6、蛋白質(zhì)的鑒定13.蛋白質(zhì)鑒定的相關要素：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點、氨基酸組成及其順序、免疫特性、結(jié)晶特性、生物學功能14.核酸分子雜交技術的原理有互補特定核苷酸序列的單鏈d

18、na或者rna混在一起時，其相應同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構，如把一段已知基因（dna或者rna）核酸序列用合適標記物（如放射性同位素、生物素等）予以標記，當作探針（probe），與變性后的單鏈基因組dna或rna進行雜交，再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學等技術）把標記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列是否存在，拷貝數(shù)及表達豐度等。15.southern blot的步驟（1）基因組dna的提取（2）限制性內(nèi)切酶酶切（3）. 瓊脂糖凝膠電泳（4）. 轉(zhuǎn)膜（5）. 與探針雜交（6）. 洗膜（7）. x射線膠片顯影16.缺口平移法的原理將dnaase i 的水解活性與大腸桿菌dna polym

19、erase i 的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相結(jié)合。 首先用e.coli的dnase i 在探針dna雙鏈上造成缺口，然后再借助于dna pol i的53外切酶活性，切去帶有5-磷酸的核苷酸；同時利用該酶53聚合酶活性，使生物素或同位素標記的互補核苷酸補入缺口。 這兩種活性同時作用，缺口不斷向3方向移動，dna鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的dna，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記dna探針。問答：1、 激光共聚焦顯微鏡相較于普通顯微鏡的優(yōu)勢在哪里，請簡述其應用。（掌握）激光共聚焦顯微鏡能夠形成完全聚集的3d樣本圖形。定位不同的熒光染料在3d樣本圖形中的著色位置。精

20、確測量二維、三維平面及空間結(jié)構。具有識別空間位置的能力從而進行三維坐標定位。節(jié)省標本處理時間很少需要進行樣本包埋用顯微切片。應用：1,檢測被一種或多熒光染料標記的樣本2,檢測樣本熒光著色位置或其他特征3,完整觀察新鮮或固定樣本內(nèi)部結(jié)構4,在活細胞或組織中描繪標記離子的熒光染料5,全程監(jiān)控gfp轉(zhuǎn)染后的細胞或組織2.冷凍干燥機的工作原理及對冷凍制品的質(zhì)量要求。（掌握）它的工作原理是將被干燥的物品先凍結(jié)到三相點溫度以下，然后在真空條件下使物品中的固態(tài)水份（冰）直接升華成水蒸氣，從物品中排除，使物品干燥。物料經(jīng)前處理后，被送入速凍倉凍結(jié)，再送入干燥倉升華脫水，之后在后處理車間包裝。真空系統(tǒng)為升華干燥

21、倉建立低氣壓條件，加熱系統(tǒng)向物料提供升華潛熱，制冷系統(tǒng)向冷阱和干燥室提供所需的冷量。本設備采用高效輻射加熱，物料受熱均勻；采用高效捕水冷阱，并可實現(xiàn)快速化霜；采用高效真空機組，并可實現(xiàn)油水分離；采用并聯(lián)集中制冷系統(tǒng)，多路按需供冷，工況穩(wěn)定，有利節(jié)能；采用人工智能控制，控制精度高，操作方便。對凍干制品的質(zhì)量要求是：生物活性不變、外觀色澤均勻，形態(tài)飽滿，結(jié)構牢固，溶解速度快，殘余水分低，要獲得高質(zhì)量的制品，對凍干的理論和工藝應有一個比較全面的了解。凍干工藝包括預凍、升華和再凍干三個分階段。合理而有效的縮短凍干的周期在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯的經(jīng)濟價值。3.分光光度計吸收池使用注意事項：（了解） 要徹底清

22、洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時可放在 1洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個小刷子清洗杯子。 嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測定吸光度“a0”，樣品杯換上樣品液后測定的吸光度為“a1”，則校正后的實際吸光度a為：a= a1a0 高檔的分光光度計有自動置零系統(tǒng)，可將二

23、個杯子的偏差置零。其他重要附件：高檔分光光度計的樣品室還可以更換各種重要附件，用于各種特殊量測。如換上“積分球”，可用來檢測微弱透光和不透光的樣品。換上“凝膠掃描裝置”，可用于電泳凝膠膠條上樣品帶的掃描測量。4如何使用熒光檢測技術對細胞調(diào)亡進行檢測（掌握）caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。caspase-3正常以酶原（32kd）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的caspase-3由兩個大亞基（17kd）和兩個小 亞基（12kd）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋

24、亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。設計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽ac-devd- amc,在共價偶聯(lián)時，amc不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出amc，自由的amc才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的amc熒光強度的大小可以測定 caspase-3的活性，從而反映caspase-3被活化的程度。5.如何使用分光光度計對核酸進行定量。（了解）核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能，可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈dna以及rna，核酸的最高吸收峰的吸收波長為260nm，每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)，如：10d

25、的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液，然而，實驗并非一帆風順，讀書不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題，靈敏度越高的一起，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。6.熒光標記引物法和終止法的異同點。（了解）1.都確定了4種熒光染料與4種ddntp所終止的dna片段之間的專一對應關系2. 熒光標記引物法使熒光有色基團標記在長短不同的dna片段的端，可理解為熒光染料標記過程和延伸反應終止分別發(fā)生在同一dna片段的兩端，且標記發(fā)生在引物與模板的退火過程中，而終止是發(fā)生在片段延伸過程中，兩者在時間上有一定間隔3. 熒光標記終止底物法使標記

26、和終止過程合二為一，兩者在同一時間完成4. 在具體操作中，前者要求a、c、g、t四個反應分別進行，而后者的四種反應可以在同一管中完成7.請比較蛋白質(zhì)測序和dna測序過程的異同點。（必考）蛋白質(zhì)測序 dna測序測序中判斷的復雜性：20種氨基酸且可能出現(xiàn)特殊的氨基酸 4種核苷酸樣品的性質(zhì)： 不同蛋白質(zhì)和肽片段理化性質(zhì)相差很大， 不同dna片段理化性質(zhì)存在不溶性和變性的問題 相差小，基本不存在不溶性和變性的問題對樣品量的依賴性：常為主要限制因素 只要建立了克隆，樣品量不成問題測序速度：手工操作者一天完成約45個殘基的 手工操作者一天可完成數(shù)百個堿基 順序， 的順序，自動測序儀一天可完成約30個殘 自

27、動測序儀一天可完成數(shù)千堿基基的順序 的順序測定 準確性：常出現(xiàn)拼接和辨讀錯誤 準確性高費用：高，對昂貴的儀器依賴性強 較低，手工方法可滿足一般測序要求8. 影響電穿孔儀和電融合儀效率的因素（了解）(一) 電脈沖的幅度、時間和脈沖波形使細胞膜不穩(wěn)定而被擊破的最低電壓稱為臨界電壓。大致上14 kv/cm的電場加在半徑為10 m的動物細胞上，即可產(chǎn)生膜的臨界電壓。植物細胞必須先把細胞壁去掉，剩下的原生質(zhì)體的穿孔和融合所需電壓與動物細胞相近；細菌的外膜相當強韌，所需臨界電壓也往往比普通動物細胞高12個數(shù)量級。脈沖的幅度只是要求條件之一脈沖的寬度也必須比膜的充電時間和膜的彈性復原時間長，這樣才能保證孔道

28、在脈沖以后有機會繼續(xù)開放一段時間。一般來說，寬度窄的脈沖，需要高幅度來彌補。太寬的脈沖往往會擊破融合區(qū)外的細胞膜，導致細胞死亡，交流脈沖或多次脈沖能夠充分利用脈沖電場的相向電泳壓力，所以往往比單個直流(方形)脈沖有效。如果穿孔用的電脈沖，在以峰電壓擊破細胞膜后能以較低的電壓維持孔道的短時間開放，則對提高穿孔效率有益，因此指數(shù)衰減的脈沖往往比同能量的方形脈沖有效。專門設計的脈沖形也許會比指數(shù)衰減形更有效，但指數(shù)衰減波形的脈沖最易制造，所以用途最廣。(二) 膠體滲透壓和細胞膨脹細胞被脈沖擊穿之后，水和一些離子可以自由進入，但大分子卻不易通過擊穿的小孔。由于滲透壓的不平衡，水、部分離子和小分子會進入

29、細胞，導致細胞繼續(xù)膨脹而破裂。除非細胞膜在破裂前就復原。為避免細胞破裂，往往需要在細胞外的緩沖液加入大分子以維持滲透壓平衡。在很多情況下，允許細胞稍微膨脹，會有助于引導藥物和分子進入細胞，當水或緩沖液進入細胞時，會把孔道擴大，同時溶解在外液中的成分會隨水流被帶進細胞。所以一般在穿孔之前，把細胞放人稍低滲透壓的緩沖液中，讓細胞略微膨脹，細胞膜的張力也因而增高，橫向張力可以幫助電壓力穿破細胞膜。已有張力的膜很容易擴大，若用于電融合過程，初成的連接孔道也會較容易開擴，因而促成融合。在轉(zhuǎn)染過程中，若需長鏈的dna或質(zhì)粒進入細胞，從理論上講，需要很長時間，但由于細胞電穿孔后的復原時間僅幾十分鐘，即使電穿

30、孔足夠大，也不可能完成這一過程。但在實驗過程中，電穿孔的轉(zhuǎn)染效率比預期高很多。(三) 細胞膜的復原穿孔后細胞膜復原的時間和過程隨細胞而異，時間的長短也由復原期間的溫度、外液的滲透壓、所含離子和藥物來決定。細胞膜復原的時間長些，有利于細胞外藥物的擴散進入細胞內(nèi)。對于有些操作過程，需要低溫來延緩復原時間。但在復原過程中，細胞膜仍然是有漏洞的，所以內(nèi)外的膠體滲透壓必須仔細調(diào)節(jié)。在這段時間內(nèi)，細胞仍然非常脆弱，所以應該避免機械振蕩，盡量避免使用移液管或離心操作。細胞外液所含的離子，一方面影響細胞復原期間的細胞生存，另一方面也影響細胞膜復原的速度。以上幾個最普通的因素，互相之間也有影響，例如，脈沖的強度

31、和寬度大，孔也越來越多，藥物進入快，融合的概率也高，但細胞對膠體滲透壓和離子平衡也敏感。因此無論穿孔或融合的效率，在脈沖電壓或?qū)挾壤^續(xù)增高的條件下，往往會先達最高效率峰，然后急劇下降，原因就在于細胞死亡。最佳效率的條件是由多種因素匹配決定的，如果了解生物物理的原理，熟悉細胞的特性，就可以設計出適當?shù)膬x器和程序，進行電穿孔和電融合。9. 熒光定量pcr的應用（了解）（1）實時監(jiān)測產(chǎn)物量，計算初始模板量（2）基礎研究的基因表達分析研究（3）臨床病原體檢測（病人體液中目標基因的檢測：病毒，寄生蟲，細菌；市場上有各種開發(fā)好的試劑盒）（4）食品衛(wèi)生檢疫（a.轉(zhuǎn)基因食品的檢疫：根據(jù)轉(zhuǎn)入基因的特異性區(qū)段設計

32、探針b.食品中病原微生物的檢測）10.pcr技術原理及特點：pcr技術又稱為聚合酶鏈式反應，其基本原理是根據(jù)細胞分裂中dna的半保留復制機理，體外合成目的dna片段的方法。pcr由變性退火延伸三個基本反應步驟構成。其特點包括：（1）靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個rfu細菌檢測的最小檢出率為3個細菌（2）簡便、快速一次性加好反應液，24 小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析（3）對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提dna11.蛋白質(zhì)分離純化的依據(jù)及其相應的分離方法。（掌

33、握）蛋白質(zhì)的分子大小：主要取決于蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目，透析、超過濾、分子篩層析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等就是依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進行分離純化蛋白質(zhì)的； 蛋白質(zhì)的帶電特性：蛋白質(zhì)肽鏈的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈r基以及堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈r基等，在不同的ph條件下會帶有不同的電荷，等電點沉淀、離子交換層析、等電聚焦電泳等都是以此為依據(jù)來分離純化蛋白質(zhì)； 蛋白質(zhì)的溶解特性：大多數(shù)蛋白質(zhì)在水溶液中會形成穩(wěn)定的膠體溶液，易溶于稀酸、稀堿或稀鹽等，當破壞膠體穩(wěn)定存在的條件時，蛋白質(zhì)會沉淀析出，硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級分離等均依據(jù)此原理； 蛋白質(zhì)的變性與復性：蛋白質(zhì)在

34、一定的物理化學條件下會失去原有的空間結(jié)構、生物學功能以及部分理化特性等稱為變性，在變性條件不劇烈，某些蛋白質(zhì)在除去變性條件后會恢復原有的空間結(jié)構和生物學功能即為復性。例如，采用尿素變性復性的方法從包含體中純化原核表達蛋白； 蛋白質(zhì)的結(jié)晶：天然蛋白質(zhì)在一定的物理化學條件下，濃度達到過飽和狀態(tài)時就會結(jié)晶析出，如從雞蛋中純化溶菌酶等就可以采取結(jié)晶與再結(jié)晶的方法； 蛋白質(zhì)分子表面的特性：蛋白質(zhì)分子表面疏水氨基酸殘基的數(shù)目、比例以及分布區(qū)域不同，因此它們與吸附劑的吸附作用力不同，蛋白質(zhì)的吸附層析就是依據(jù)此原理； 蛋白質(zhì)的分子形狀：不同的蛋白質(zhì)具有不同的分子形狀，因此其與特定的配基(或配體)具有專一的結(jié)合特性，如酶與底物、酶與其抑制劑或激活劑，抗體與抗原，凝集素與葡聚糖等，親和層析就是以此為依據(jù)12.實驗設計大腸桿菌中表達的融合有組氨酸標簽的綠色熒光蛋白的分離純化（了解） (1)選擇實驗材料：大腸桿菌(含有his-gfp表達質(zhì)粒)在液體lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心，除去lb培養(yǎng)基，收集菌體沉淀。(2)實驗材料預處理：用蛋白質(zhì)提取緩沖液懸浮菌體，離心后收集菌體沉淀，再用蛋白質(zhì)提取緩沖液洗滌菌體一次，用少量提取緩沖液懸浮菌體，冰浴條件下超聲波破碎菌體，離心后的上清液即為綠色熒光蛋白粗提取液。(3)蛋白質(zhì)粗分級：將綠色熒光蛋白粗提取液裝入透析袋中濃縮，透析除