《分子生物學》教學課件：04 以修復作用為中心的DNA的安全保障體系

1、第四章 以修復作用為中心的DNA的安全保障體系,本章主要內容,1 復制修復 2 損傷修復 (1)胸腺嘧啶二聚體的形成 (2)胸腺嘧啶二聚體修復機制：光修復和暗修復:切除修復、重組修復、SOS修復和二聚體糖基酶修復系統(tǒng) 3 限制與修飾,第一節(jié) 復制修復,復制修復包括： 1 DNA聚合酶的校對功能：正在DNA聚合過程中發(fā)生，錯誤的堿基并不存在于DNA鏈的內部，只是瞬時存在于鏈的生長點上。 2 尿嘧啶糖基酶修復系統(tǒng)和錯配修復系統(tǒng)：修復的錯誤已存在于新生的DNA鏈內部。,一、尿嘧啶糖基酶系統(tǒng),這一系統(tǒng)包括尿嘧啶-N-糖基酶、AP（無嘌呤）內切核酸酶、Pol和DNA連接酶。 主要功能是識別新生鏈中滲入的

2、尿嘧啶dUTP并將其切除修復。 尿嘧啶來源：（1）細胞內胞嘧啶的自發(fā)的脫氨氧化而生成。（2）少數(shù)尿嘧啶逃脫了dUTPase的作用而滲入新生的DNA鏈中。,二、錯配修復系統(tǒng)（mismatch repair sysytem）,DNA聚合酶偶爾能催化不能與模板形成氫鍵的錯誤堿基的滲入。 可以為DNA聚合酶所識別并進行錯配修復，但在某些特殊的情況下沒有進行糾正。這種錯誤的頻率為10-8。 但實際上這種錯配的頻率為10-10或10-11。推測一定存在另一個修復系統(tǒng)給予第二次糾正錯誤的機會。即錯配修復系統(tǒng)。,錯配修復系統(tǒng)如何識別錯誤？,細胞中甲基化作用與這種識別有關。 在DNA中，天然的甲基化堿基有兩種，

3、一是5-甲基胞嘧啶，另一是N6-甲基腺嘌呤。 腺嘌呤的甲基化是錯配修復系統(tǒng)的識別標志。這一標志具有堿基序列特異性， N6-甲基腺嘌呤一般都包含在GA*TC的順序中。,沿著新生DNA鏈有一個甲基化梯度，靠近復制叉處甲基化程度最小，親本鏈上的甲基化程度高而且均一。正是根據(jù)這些特征，錯配修復系統(tǒng)可以識別出新生鏈和親本鏈，從而糾正新生鏈上的不配對堿基。,錯配修復系統(tǒng)主要包括一個能識別新生鏈上錯配堿基和未甲基化的GATC序列的內切核酸酶，稱為錯配矯正酶。DNA聚合酶和連接酶。 甲基化作用是甲基化酶所催化的。即N6-甲基腺嘌呤是由dam基因所編碼的DNA腺嘌呤甲基化酶催化所產(chǎn)生的。,第二節(jié) 損傷修復,生物

4、體內外有許多因素能造成DNA分子結構的損傷。如紫外線、烷化劑、氧化劑等。一種因素可能造成多種類型的損傷；一種類型損傷也可能源于不同因素的作用。 DNA的損傷類型很多，其中以胸腺嘧啶二聚體的形成和修復機制研究最為清楚。,一、胸腺嘧啶二聚體的產(chǎn)生,堿基在各種化學和物理因素的作用下，產(chǎn)生了堿基的衍生物，最常見的是胸腺嘧啶二聚體。 紫外照射可以使DNA分子中同一條鏈相鄰的胸腺嘧啶堿基形成以共價鍵連接成環(huán)丁烷結構的二聚體。,由于相鄰的胸腺嘧啶產(chǎn)生二聚體，兩個堿基平面被環(huán)丁基所扭轉，引起雙螺旋構型的局部變化，同時氫鍵的結合力也顯著降低。這樣，當以胸腺嘧啶二聚體的DNA作為模板進行復制時，DNA聚合酶將兩個

5、腺嘌呤加上去，但由于不能很好的形成氫鍵，然后又由Pol的3 5校對功能而將之水解除去。這樣的事件反復發(fā)生，因而產(chǎn)生一個空耗的過程，即大量的dATP被分解，而DNA的復制毫無進展。,由于蛋白質在不斷的合成，而DNA的復制不能進行，導致細胞也不能分裂。這樣就出現(xiàn)細絲狀的所謂蛇形細胞，最終死亡。,二、 胸腺嘧啶二聚體修復的生物學指征,活存曲線：以紫外線照射為例，可以在不同的時間取樣，以菌落的形成能力作為指標，將存活的百分比和照射時間做成的曲線。 修復有多種類型，主要有光修復和暗修復。 光修復又稱為光復活作用。即細菌在紫外線照射后，立即用可見光照射可以顯著增加細菌的活存率，并且細菌的活存率隨著可見光的

6、劑量的增加而增加。,液體保持恢復：如將紫外線照射的細菌置于黑暗非營養(yǎng)性的溫暖的緩沖液之中，也可以顯著地增加細菌的活存率，這種效應稱為。 其實質即是在這樣的條件下有利于各種暗修復的進行。,三、胸腺嘧啶二聚體修復的分子生物學機制,對于胸腺嘧啶二聚體主要有五種修復機制：光修復和暗修復（切除修復、重組修復、SOS修復及二聚體糖基酶修復）。 二者區(qū)別： 光修復機制是利用光能來切除二聚體之間的C-C鍵，而暗修復所需的能量由ATP提供。 光修復只作用于紫外線照射所造成的損傷；暗修復除了可以修復紫外線照射所造成的損傷外，還可以修復其他類型的損傷。 光修復只需要一個光復活酶；而暗修復需要許多酶的共同作用。,1

7、光修復（photoreactivation）,光復活作用是在可見光（300600nm）的活化之下由光復活酶催化胸腺嘧啶二聚體分解為單體的過程。 幾乎所有的生物細胞中多發(fā)現(xiàn)了光復活酶（PR酶）。 PR酶首先與DNA鏈上的胸腺嘧啶二聚體結合形成復合物；這種復合物以某種方式吸收可見光并利用光能切斷胸腺嘧啶二聚體之間的C-C鍵。胸腺嘧啶二聚體變?yōu)閱误w，則PR酶從DNA鏈上解離下來。,2 切除修復,切除修復是一種多步驟的酶反應過程。這多步驟歸納為“切-補-封”三個步驟。 第一步為切開，修復內切酶在胸腺嘧啶二聚體的兩側都做一切口，切下包括損傷在內的12核苷酸（E.coli）的單鏈片段。 修復內切酶并不能直

8、接識別受損傷的部位，它識別的是非正常DNA形狀。只要DNA的正常雙螺旋發(fā)生變形，就能被修復內切酶所識別。,以E.coli為例：其修復內切酶由三個亞基UvrA、UvrB和UvrC構成。其中UvrA具有ATP酶活性；UvrA和UvrB的復合物有修復內切酶功能，但如果和UvrC形成更大的復合物，則修復內切酶的活性達到最大。這三個基因的任何一個發(fā)生突變，都會增加細菌對紫外線的敏感性。,根據(jù)切除DNA片段的長短，可以分為“短補丁修復”和“長補丁修復”。大約99%的切除修復為“短補丁修復”，切除的DNA一般不超過30個核苷酸。1%的“長補丁修復”，切除的DNA大多在1500個核苷酸左右，但有達9000以上

9、的核苷酸被切除。,3 重組修復,UvrABC的任何一個突變都會提高細菌對紫外線的敏感性，尤其是UvrA。如果UvrA，則平均使一個細胞死亡的紫外線劑量能在細胞內產(chǎn)生300個胸腺嘧啶二聚體。而沒有被修復的一個胸腺嘧啶二聚體就足以使細胞死亡。但細胞并沒死亡，表明在細胞體內還有其他修復途徑消除胸腺嘧啶二聚體造成的后果。,實驗發(fā)現(xiàn)，正常的遺傳重組所必須的基因recA發(fā)生突變，對紫外線更為敏感。因此認為recA基因必定是作為另一種修復系統(tǒng)的成員而起作用。 在recA中，二聚體的切除能正常進行，推測recA所參與的修復機制與切除修復完全不同。,recA對于紫外線比UvrA更為敏感，表明Rec修復系統(tǒng)比切除

10、修復更為有效。,胸腺嘧啶二聚體會引起Pol在二聚體上進行反復的的聚合和水解，使dATP大量空耗，最終大致細胞死亡。但recA+在細胞中，DNA合成的抑制現(xiàn)象不會持久，細胞可以通過兩種途徑使DNA復制繼續(xù)進行，一種即為有重組修復系統(tǒng)負責的二聚體后起始；另一種由SOS修復系統(tǒng)負責的超越二聚體合成。,重組修復系統(tǒng)中，DNA復制到胸腺嘧啶二聚體時，大約會停留5s，又在二聚體的后面以一種未知的機制起始DNA的復制。這樣，模板鏈上有一個二聚體，子鏈上就會有一個缺口。這樣的DNA分子不經(jīng)修復，是不可能再作為母板進行復制的。,可以通過姐妹鏈交換的機制，產(chǎn)生一條完整的DNA鏈。雖然損傷的鏈還存在，但會隨著細胞分

11、裂的進行，在細胞群體中逐漸稀釋。,重組修復是非常重要的修復，它不必像切除修復那樣等待很長的時間才能復制，而是先復制后修復。Uvr系統(tǒng)負責切除大量的胸腺嘧啶二聚體，而Rec系統(tǒng)則負責消除那些沒有被切除的二聚體可能造成的死亡后果。,在這個系統(tǒng)中，最關鍵的是recA基因。RecA具有催化DNA分子之間的同源會聯(lián)和交換單鏈的作用，而且還有單鏈DNA結合活性及由此產(chǎn)生的蛋白酶活性。即有重組活性、單鏈DNA結合活性和蛋白酶活性。 正是這種蛋白酶的活性誘發(fā)了許多基因特別是修復系統(tǒng)基因的表達，其中包括切除修復系統(tǒng)、重組修復系統(tǒng)和SOS修復系統(tǒng)。,4 SOS修復,SOS修復是一種旁路系統(tǒng)。它允許新生的DNA鏈越

12、過胸腺嘧啶二聚體而復制，其代價是保真度的極大喪失。這是一個錯誤潛伏的過程。有時盡管合成了一條和親本一樣長的DNA鏈，但常常是沒有功能。 其原則：喪失某些信息存活總比死亡好。,SOS修復機制目前還不清楚，但認為SOS修復機制會導致校對系統(tǒng)的松懈，喪失了識別雙螺旋結構變形的能力。從而使復制能越過胸腺嘧啶二聚體進行。兩個腺嘌呤也加到與二聚體相對的位置。 由于校對功能的喪失，在新合成的鏈上有比正常情況下多得多的錯配堿基。,SOS修復與切除修復不同，切除修復系統(tǒng)的酶在正常細胞中就已經(jīng)存在；而SOS 系統(tǒng)的酶只有細胞受到損傷時才出現(xiàn)。當紫外線照射細菌時，SOS系統(tǒng)就開啟。 SOS修復系統(tǒng)中研究得最為清楚的

13、是recA和lexA基因（紫外線抗性基因）。 在正常的細胞中，SOS系統(tǒng)是關閉的。生物在長期的進化過程中，已經(jīng)有了優(yōu)良的校對功能以在復制中保持極高的準確性，因此必須使SOS這個錯誤潛伏的復制過程關閉。這個作用是通過lexA基因的產(chǎn)物而實現(xiàn)的。,LexA蛋白是一種阻遏蛋白，結合于SOS系統(tǒng)中各基因的操作子上，使這些基因沒有活性，很少產(chǎn)生轉錄產(chǎn)物，從轉錄水平上控制了這些基因。 在細胞內，DNA合成正常進行時，RecA蛋白是沒有蛋白酶活性的。這種活化作用需要單鏈的存在。其活性只作用于少數(shù)特定的蛋白質，LexA蛋白就是其中之一。,LexA蛋白被水解為兩個片段，就不再阻止SOS的基因轉錄，SOS系統(tǒng)即開

14、啟。當修復完成后，DNA合成轉入正常，RecA蛋白又失去蛋白酶活性，LexA蛋白又得以控制SOS系統(tǒng)的基因的轉錄。,SOS修復只是SOS反應的一部分。細菌在UV、絲裂霉素C、烷化劑等作用下，造成DNA損傷，從而抑制DNA的復制，都會使細胞產(chǎn)生一系列的表型變化，包括對損傷DNA的修復能力迅速增強、誘變率的提高、細胞分裂的停止及噬菌體的誘導釋放等。這些反應通稱為SOS反應。 其他凡是能抑制DNA復制的因素，如胸腺嘧啶饑餓、DNA復制抑制劑及某些重要的基因，如dna基因突變等，均能觸發(fā)SOS修復。,5 嘧啶二聚體糖基酶修復系統(tǒng),當T4噬菌體感染大腸桿菌細胞時，其denV基因的產(chǎn)物即為嘧啶二聚體糖基酶

15、。具有AP內切酶活性。與尿嘧啶糖基酶的修復機制基本相同。 AP內切酶：無嘌呤內切核酸酶。不僅負責修復去嘌呤作用造成損傷，而且負責修復DNA中的尿嘧啶和次黃嘌呤等。,總結,只有光修復能利用光能，其他只能利用ATP水解所釋放的能量。 光復活、切除修復和二聚體糖基酶修復的都是模板鏈，重組修復是形成一條新的摸板鏈，SOS修復是產(chǎn)生連續(xù)的子鏈。 SOS修復是唯一導致突變的修復，其余的修復機制是將損傷的DNA鏈恢復到損傷前的狀態(tài)或產(chǎn)生與親本相同的子代DNA。,四 其他損傷類型及其修復,1 非標準堿基：在DNA 分子中，除了尿嘧啶能在DNA復制時滲入外，胞嘧啶也能自發(fā)地脫氨氧化成為尿嘧啶。腺嘌呤也可以脫氨氧

16、化生成次黃嘌呤。還有其他堿基衍生物會存在于DNA鏈中，如3-甲基腺嘌呤，6-氫-5，6-二羥胸腺嘧啶，2，4-二氨基-6-羥-5-N-甲基甲酰亞氨嘧啶，嘧啶二聚體等。 這些非標準堿基均已發(fā)現(xiàn)其相應的DNA糖基酶。,2 堿基的丟失,DNA中的脫氧核糖,一方面使主鏈更穩(wěn)定,另一方面使糖苷鍵的穩(wěn)定性低于RNA。DNA的雙螺旋結構克服了這一缺陷，但嘌呤堿基仍易自發(fā)水解，這一過程稱為去嘌呤作用。 在生理條件下，自發(fā)的去嘌呤速度為310-11/s，而自發(fā)去嘧啶的速度低20倍。 在實驗室中，可以用降低pH和提高溫度的方法促進去嘌呤作用。某些烷化劑，如乙磺酸乙酯能在嘌呤環(huán)的第7位氮原子上接上烷基，這種烷化作用

17、極大地減弱了第9為N原子上的糖苷鍵，因而發(fā)生去嘌呤作用。 AP內切酶負責修復去嘌呤作用造成損傷。,第三節(jié) 限制和修飾,一、 限制-修飾現(xiàn)象 二、限制-修飾系統(tǒng),一、 限制-修飾現(xiàn)象,上世紀50年代,發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象。噬菌體表現(xiàn)出的寄主限制和修飾作用具有代表性和普遍。,由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象-20世紀60年代，Linn和Arber 發(fā)現(xiàn),(K),大腸桿菌B,大腸桿菌K,1,1,410 4,10 4,E.O.P 成斑率 efficiency of plating,外源DNA,自身DNA,（一）核酸限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)：切酶。,限制修飾的酶學系統(tǒng),酶切位點 不被修飾,噬菌體DNA 被切割,酶

18、切位點 被修飾,基因組DNA 不被切割,E.coli K和E.coli B株都含有一種限制修飾系統(tǒng)，其限制性內切酶能將外來的入侵者的DNA切斷。每一種內切酶在DNA上都有一定的結合位點。當菌株自身有這樣的識別位點，則該菌株的甲基化酶就在這些識別位點上將腺嘌呤甲基化，成為N6-甲基腺嘌呤；或者將胞嘧啶甲基化，成為5-甲基胞嘧啶。這樣，限制性內切酶就不會將自身的DNA降解掉。著兩方面結合，就稱為限制-修飾作用。,當不同來源的噬菌體進入另一種大腸桿菌時，絕大多數(shù)被限制酶降解，但有極少數(shù)的噬菌體先被宿主的甲基化酶所修飾而逃脫了宿主限制性內切酶的降解，從而存活下來。這些幸存者的后代因為有新宿主的修飾標記

19、而缺少祖代的修飾標記，因此只能感染新的宿主類型，而不再能感染祖代宿主。 大腸桿菌C株沒有限制酶，因而其他來源的噬菌體能感染C株，但C株來源的噬菌體不能感染K株和B株。 細菌即借助限制和修飾系統(tǒng)，區(qū)別自身DNA和入侵DNA。,凡是限制-修飾模式相同的DNA均為自身DNA，這不僅包括同株系的不同個體的DNA，還包括寄生于這些菌株中的質粒和噬菌體。 有些菌株的細胞染色體并沒有限制和修飾系統(tǒng)的基因，其限制修飾系統(tǒng)是由寄生于其中的質?；蚴删w賦予寄主。因此，有的菌株的差別不在于細菌本身，而在于它所含有的質粒和噬菌體的不同。 同一細胞中的不同類型的DNA，包括細胞DNA、質粒DNA 和噬菌體DNA等，統(tǒng)稱

20、為該細胞中的居民DNA。,最早分離出的限制內切酶1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，沒有實用價值。 首個II型限制內切酶1970年，H.O.Smith等從Heamophilus influenzae(流感嗜血桿菌)的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。 從此，相關研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內切酶中，其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的 。,二、限制-修飾系統(tǒng),限制性核酸內切酶（restriction endonuclease ）：是能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并

21、由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。切開的是3，5磷酸二酯鍵。,（二）限制性核酸內切酶的類型及其主要特性,特性 1. 限制修飾活性 2. 內切酶的蛋白 質結構 3. 限制輔助因子 4. 切割位點 5. 特異性切割 6. 基因克隆中,I 型 雙功能的酶 3種不同亞基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 距特異性位點5端至少1000bp 不是（隨機） 無用,II 型 限制酶和修飾酶分開 單一成分 Mg2+ 位于識別位點上 是 非常有用,III 型 雙功能酶 2種亞基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 特異性位點3端24-26bp處 是 用處不大,（三）限制性核酸內切酶的命名,1、寄主菌屬名的第一

22、個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體 字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為 Hin； 2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind； 3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則 用羅馬數(shù)字標出，比如Eco R I、 Hind III。,（四）II型限制性核酸內切酶的基本特點,1、識別位點的特異性 每種酶都有其特定的DNA識別 位點，通常是由48個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。 2、識別序列的對稱性 靶序列通常具有雙重旋轉對稱 的結構，即雙鏈的核苷酸

23、順序呈回文結構。 3、切割位點的規(guī)范性 交錯切或對稱切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。,幾種II型限制性核酸內切酶的酶切位點,與II型核酸內切酶有關的幾個概念,粘性末端 cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。 平 末 端 Blunt end在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結構。則不易于重新環(huán)化。,同裂酶 isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。 同尾酶 isocaudamers 識別的靶

24、序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內切酶。如BamH I 、BclI、BglII和 Xho I 是一組同尾酶。 注 意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。,平齊末端,帶5P端的黏性末端,帶3OH 和5P端的平末端,例如Hpa和Msp是同裂酶，識別順序都是 5C|CGG3 3GGC|C5 如果其中有5-甲基胞嘧啶，Hpa不能夠切割，MspI能切割。,經(jīng)同尾酶消化的DNA末端連接示意圖,5 XXXXGGATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAGGXXXXXX 5,BamH I,5 XXX

25、XG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 5,5 XXXXAGATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGAXXXXXX 5,Bgl II,5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 5,一個限制酶單位（U）指：在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37）下，1h內中完全降解1 g DNA所需要的酶量。 影響酶活性的因素很多，最重要的有： DNA的純度 DNA的甲基化程度 酶切反應的溫度（通常為37 ） DNA的分子結構 核酸內切限制酶的緩沖液 在“非最適的”反應條件下,有些核酸內切限制酶識別序列的特異性便會

26、發(fā)生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號活性。用*表示。,（五）限制性核酸內切酶的消化反應,酶 切 反 應 的 基 本 步 驟,電泳,紫外分析,37 1h,加反應液,CK,M,Buffer (10X) 2.0 L ddH2O 約16.5 L DNA 0.21.0 g Enzyme 12U Volume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,目前已發(fā)現(xiàn)600多種限制性內切酶，分為三類。根據(jù)限制-修飾特性，這三類又分為兩大組： （1）type，它與相應的甲基化酶是分開的，不屬同一個分子。這類酶的數(shù)量占絕大多

27、數(shù)。在重組DNA技術和生化分析技術中常用此類酶。,（2）type和type：它們的限制酶和甲基化酶都作為亞基包含在同一個酶分子中。所以這二類應該是修飾-限制酶。,類酶的識別位點一般為46bp的回紋序列，這種對稱性意味著這些位點的兩條DNA鏈上均有可被甲基化的堿基。 甲基化狀態(tài)有三種：全甲基化、半甲基化和非甲基化。 全甲基化的為點既不被限制，也不被修飾；半甲基化的位點也不被限制，但可被修飾成為全甲基化；非甲基化的位點在體外既可被限制酶識別，也可被修飾酶甲基化，在體內可能主要被限制酶切斷。,在居民DNA上，都是全甲基化的。隨著DNA的復制，產(chǎn)生的子代DNA都是半甲基化的；但不久在復制過程中和復制結

28、束后的短時間內即完成全甲基化過程。而外源DNA絕大多數(shù)被限制。 類限制酶的切割位點就在識別位點內或其附近。由于兩條鏈的切口位置不同，可以產(chǎn)生粘性末端（sticky ends或cohesive ends）和平末端（blunt ends或flush ends）。,粘性末端可以是5粘性末端，也可以是3粘性末端。有的類限制酶的識別位點的序列相同（切點不一定相同），這些酶稱為同位酶。有的類限制酶的作用后產(chǎn)生的DNA粘性末端相同（識別位點的序列不一定相同），這些酶稱為同尾酶。 同尾酶產(chǎn)生的粘性末端給DNA重組帶來了很大的方便。如Bgl的識別位點為AGATCT，BamH的 識別位點GGATCC，它們產(chǎn)生相同

29、的粘性末端5GATC，因此這兩個酶所產(chǎn)生的DNA片段可以互相連接。但產(chǎn)生新的序列，AGATCC或GGATCT，可以被另一種酶BstY所識別。,類酶的種類較少，以EcoK和EcoB來說明。它們的限制酶和修飾酶各作為一個亞基存在于酶分子中，即R亞基和M亞基；還有一個S亞基負責識別DNA鏈的特異性位點。 在EcoK中的三個亞基分別由位于同一個操縱元的基因hsdR、hsdM、hsdS編碼。其組成為R2M2S。,EcoB的操縱元有兩個啟動子，其順序是p1hsdRp2hsdMhsdS。啟動子能使M、S基因獨立于R基因之外表達。EcoB的組成是R2M4S2。 hsdR經(jīng)營突變體的表現(xiàn)型為R-M+，即對DNA不能限制，只能修飾。hsdS基因突變體的