流式細(xì)胞術(shù)基本原理PPT參考課件

1、流式細(xì)胞術(shù)基本原理,陳曉東 產(chǎn)品技術(shù)專(zhuān)員,廣州市珈源醫(yī)學(xué)試劑有限公司,流式細(xì)胞術(shù),流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選 研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量,2,流式細(xì)胞儀的特點(diǎn),單個(gè)細(xì)胞/生物顆粒分析 同時(shí)多參數(shù)、多熒光分析 高通量檢測(cè)/高速度 10000個(gè)細(xì)胞/秒以上 定性/定量分析 分選特定性狀或功能的細(xì)胞 可檢測(cè)的樣本種類(lèi)多樣 (1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞

2、 (2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液,3,目前流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)的類(lèi)別,細(xì)菌,浮游生物,DM：0.2m 15m,單核細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,紅細(xì)胞,4,5,流式細(xì)胞儀的基本構(gòu)造,激光發(fā)射器 發(fā)出所需要的波長(zhǎng)的激光,前向散射光檢測(cè)器,側(cè)向散射光檢測(cè)器,光學(xué)濾鏡,流動(dòng)室與液流系統(tǒng)：將細(xì)胞單個(gè)壓入流動(dòng)室,信號(hào)收集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),光源與光學(xué)系統(tǒng),6,流動(dòng)室,7,當(dāng)光子遇到濾片時(shí)，光子或通過(guò)濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。,光學(xué)濾片,8,光學(xué)濾片的種類(lèi),長(zhǎng)通濾片（LP）：630LP 短通濾片（SP）：550SP 帶通濾片（BP）: 488/10,9,10,共有兩類(lèi)：散射信號(hào)與熒光信號(hào) 前向角散

3、射信號(hào)（FSC） 反映細(xì)胞大小 側(cè)向角散射信號(hào)（SSC） 反映細(xì)胞顆粒度 熒光信號(hào)（FL Signals）（FL1、2、3） 胞內(nèi)、胞外染色情況,流式細(xì)胞儀可獲取的信號(hào)種類(lèi),11,FSC和SSC,直方圖,流式細(xì)胞儀顯示圖的種類(lèi),12,把前向散射光圖和側(cè)向散射光圖的一維圖像在二維圖像上投影，便是我們平常所看到的流式圖。 所以橫坐標(biāo)表示的是細(xì)胞的直徑大小；縱坐標(biāo)表示的是細(xì)胞的復(fù)雜程度。 兩者相結(jié)合就能說(shuō)明細(xì)胞種類(lèi),散點(diǎn)圖,13,二維等高圖和密度圖,14,假三維圖與三維圖,15,流式細(xì)胞儀如何獲取細(xì)胞信號(hào)？,FSC SSC FL,16,前向角信號(hào)（Forward Scatter，F(xiàn)SC）,17,前向

4、角信號(hào)：細(xì)胞的大小,18,19,側(cè)向角信號(hào)（Side Scatter， SSC）,20,21,FL,22,23,FSC、SSC、FL,24,如何分離90角內(nèi)的各種熒光信號(hào)？,25,熒光染料,吸收某一波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出大于吸收光波長(zhǎng)的光波的物質(zhì),PI,488n,600nm,26,熒光染料種類(lèi),熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)射波長(zhǎng)(nm) 用途 顏色 FITC 488 525 免疫熒光 綠色 PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 PerCP 488 670 免疫熒光 紅色 PI 488 620 DNA染色 橙紅 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅 PeCy5 488 675 免疫

5、熒光 紅色 APC 633 670 免疫熒光 紅色 DAPI 359 462 DNA染色 藍(lán)色,27,熒光染料光譜特征,28,熒光分離原則,在流式細(xì)胞儀中，一般經(jīng)過(guò)LP或SP濾片將熒光大致分開(kāi)后，再經(jīng)過(guò)一BP濾片分離出特征熒光,29,開(kāi)放式光路 Calibur、Influx,流式細(xì)胞儀的光路,30,封閉式光路（Canto、LSR系列、Aria系列）,31,分選,將目標(biāo)細(xì)胞分離并富集，進(jìn)行后續(xù)研究。 分選純度99%,32,震蕩,33,偏轉(zhuǎn)板,34,幾個(gè)概念,信號(hào)放大模式 信號(hào)類(lèi)型 CV值 樣本流速 激光延遲 液滴延遲 熒光補(bǔ)償 閾值 門(mén) 對(duì)照,35,信號(hào)放大 PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，調(diào)整PM

6、T的電壓，信號(hào)強(qiáng)度將隨之改變,光信號(hào),光電倍增管（PMT）,放大器,電信號(hào),放大器兩種放大方式： 線性放大（lin） 對(duì)數(shù)放大（log）,36,線性放大（lin）,按光強(qiáng)度的線性關(guān)系輸出信號(hào).適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物過(guò)程的信號(hào)，如DNA含量、總蛋白含量等。,37,對(duì)數(shù)放大（log）,按光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)關(guān)系輸出信號(hào).在免疫學(xué)測(cè)量中通常使用對(duì)數(shù)放大。,38,電脈沖信號(hào)類(lèi)型,將與電脈沖信號(hào) 強(qiáng)弱相關(guān)的電壓 數(shù)字化 有三類(lèi)電脈沖信號(hào) 高度信號(hào)H 面積信號(hào)A 寬度信號(hào)W,39,CV值,CV值（變異系數(shù)）： 樣品均一度及儀器分辨率的標(biāo)志,CV值一般2%,40,樣本流速,41,高流速：一般用于定

7、性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速：一般用于對(duì)分辨率要求較高的分析，如DNA分析。,樣本流速選擇,42,激光延遲（laser delay）,Laser 1,Laser 2,43,液滴延遲（drop delay）,44,顏色補(bǔ)償,采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標(biāo)記的樣本時(shí)，都需要作顏色補(bǔ)償。,45,FITC主要由FITC的檢測(cè)器檢測(cè)，但部分光也會(huì)進(jìn)入PE檢測(cè)器。如果單染FITC，同時(shí)打開(kāi)PE檢測(cè)器，則如圖：,46,閾值,信號(hào)放大過(guò)程會(huì)產(chǎn)生不需要的脈沖信號(hào)，通常來(lái)自于碎片。通過(guò)設(shè)定某一信號(hào)的最低強(qiáng)度值，可將不需要的脈沖信號(hào)去除，這一設(shè)定值稱(chēng)為閾值。,屏蔽噪音信號(hào)和碎片信號(hào),47,門(mén)（Gate）,分析/分選感興趣的細(xì)胞群,48,對(duì)照,同型對(duì)照：為沒(méi)有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2，用于檢測(cè)和消除（一抗）非特異性結(jié)合到組織細(xì)胞而產(chǎn)生的背景染色