胚胎嵌合技術(shù).ppt

1、第七章 胚 胎 嵌 合 技 術(shù),王 子 玉 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物胚胎工程技術(shù)中心,動物克隆,主要內(nèi)容,一、研究概況 二、嵌合體動物定義 三、生產(chǎn)方法 四、應(yīng)用前景 五、嵌合體研究存在的 問題,一、研究概況,嵌合體 (chimera)一詞源于古希臘神話，其意是指獅頭、羊身、龍尾等部分拼湊起來的怪獸。 中國的“龍”：九似 圖騰 “龍角似鹿、頭似駝、眼似鬼、項似蛇、腹似蜃、鱗似鯉、爪似鷹、掌似虎、耳似?！?嵌合在生物學(xué)上是指同一個體中，基因型相異的細(xì)胞或組織混合存在的狀態(tài)。,現(xiàn)代的胚胎工程技術(shù)中，也有一種叫胚胎嵌合的技術(shù)。它是將個胚胎細(xì)胞（同種或異種動物胚胎）合并，共同發(fā)育成個胚胎，即“嵌合胚胎”，然

2、后將這個胚胎移植給受體，讓其妊娠產(chǎn)仔。如果產(chǎn)下來的幼仔具有以上種動物胚胎的細(xì)胞，則稱其為“嵌合體動物”。 例如，用同一種類的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相間的花小鼠；不同種類的綿羊和山羊胚胎細(xì)胞嵌合，可生下綿山羊，它既有綿羊的特征，又有山羊的特征。,美國科學(xué)家將人類的干細(xì)胞加入到了許多動物的胚胎中，制造長著人的器官的嵌合體動物，例如豬體內(nèi)流著人的血液的“人豬”，羊體內(nèi)的肝臟80%的成分屬于人類的肝臟的“人羊”，老鼠頭顱里加入人的腦細(xì)胞的“人鼠”等。 “當(dāng)人的器官在動物的體內(nèi)生長，擁有人類細(xì)胞的豬或老鼠，是不是會像人類一樣思考，卻和動物一樣行事？” “它們所帶給人類社會的恐懼，早已超越了人類認(rèn)

3、知的界限和人類對科學(xué)成果的接納空間”。,“嵌合體”是在生物界非常普遍的自然現(xiàn)象。 孿生子在同一個子宮中發(fā)育時會發(fā)生細(xì)胞交流，大多數(shù)孿生子體內(nèi)都攜帶著某些來自其同胞的細(xì)胞，他們都是嵌合體。 在胎兒發(fā)育過程中，母體和胎兒也會發(fā)生細(xì)胞交流（從孕婦血液中可檢測到胎兒的細(xì)胞），多數(shù)母親體內(nèi)終生攜帶著她們生下的子女的某些細(xì)胞，許多人體內(nèi)也攜帶著他們的母親的某些細(xì)胞，這些母親、子女也都是嵌合體。 那些接受器官移植的人，更全都是嵌合體。,不同的物種也可以形成嵌合體。 例如把兩個來自異種動物的胚胎嵌合成一個胚胎，就可以培育出異種嵌合體動物，像綿羊-山羊嵌合體、馬-斑馬嵌合體等都已培育成功。 許多心臟病患者移植了

4、豬或牛的瓣膜，也是異種嵌合體。 重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)事實上也都是在制造分子層次上的嵌合體。,用日本黑牛精子與荷斯坦母牛卵母細(xì)胞受精和利木贊牛精子與日本紅牛卵母細(xì)胞受精，通過體外胚胎聚合的方法，獲得2頭四品種嵌合體牛 鈴木達(dá)行1998,二、嵌合體動物定義,天然嵌合體？,騾子：不是。是雜種,三、生產(chǎn)方法,1 囊胚顯微注射法： 用顯微操作技術(shù)將供胚的全部內(nèi)細(xì)胞團注入除去部分內(nèi)細(xì)胞團的受胚囊胚腔中，或?qū)⒐┡叩牟糠謨?nèi)細(xì)胞團注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周間隙）注入16細(xì)胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干細(xì)胞或已分化的細(xì)胞，使其發(fā)育為嵌合胚胎的方法即為囊胚注入法。 囊胚腔注射法嵌合體獲得率最

5、高,2. 聚合法,是指將去除透明帶的兩枚8細(xì)胞至桑葚期胚胎，或來自兩個不同胚胎的卵裂球，或卵裂球與胚胎聚合在一起的方法。,酶消化法去除透明帶,0.2-0.5鏈霉蛋白酶在25-27下處理3min，移入含BSA（牛血清白蛋白）的培養(yǎng)液中終止酶的消化作用，用培養(yǎng)液洗凈卵子（三次）。,裸胚聚合：移入胚胎聯(lián)結(jié)液小滴（植物凝集素A，PHA，起粘合作用）中，培養(yǎng)10-20min，將融合胚輕輕移入20% PBS中洗滌兩次，繼續(xù)培養(yǎng)5h-10h后，移植入同期發(fā)情的受體輸卵管或子宮角中。,卵裂球聚合：取相同數(shù)量的兩個不同種屬的卵裂球裝入空的透明帶內(nèi)，加入PHA使其聚合，用瓊脂包埋后體外直接培養(yǎng)或移入兔輸卵管中使其

6、發(fā)育至囊胚，最后再移入受體子宮角內(nèi)。 卵裂球與胚胎聚合：將解離好的卵裂球慢慢釋放于另一個裸胚的正上方，使二者直接接觸，借助于PHA的作用使之聚合。,四、應(yīng)用前景,胚胎嵌合是哺乳動物胚胎工程的重要組成部分，作為一種特殊的研究手段，在發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)以及動物生產(chǎn)等領(lǐng)域都有著重要的作用。,1.在發(fā)育及細(xì)胞生物學(xué)方面的運用,(1)研究胚胎分化規(guī)律 胚胎嵌合技術(shù)是研究分析哺乳動物發(fā)生機制的重要手段之一。將基因型不同的胚胎細(xì)胞嵌合在一起，根據(jù)其在嵌合體組織或器官中的分布及存活率情況，研究胚胎早期分化的規(guī)律。 同時，通過嵌合胚胎內(nèi)細(xì)胞團以外的細(xì)胞，可以研究各類胚細(xì)胞核的全

7、能性及其正常分化能力。,(2)研究性分化機理 利用嵌合體可以研究性別分化以及參與性分化的細(xì)胞及其規(guī)律。 (3)孤雌生殖 利用嵌合體技術(shù)，己獲得了孤雌生殖小鼠。胎盤發(fā)育不全。 鈴木達(dá)行等（1998）通過聚合從日本紅牛獲取的卵母細(xì)胞的孤雌生殖二倍體胚胎和用荷斯坦母牛卵母細(xì)胞進行IVF的胚胎，獲得2死1活3頭嵌合體犢牛。,2.在免疫學(xué)與醫(yī)學(xué)方面的運用,(1)用于免疫功能的分析 通過分析嵌合體中白細(xì)胞的免疫應(yīng)答，可揭示正常的免疫防御機理。 (2)建立遺傳病動物模型 人類大多數(shù)遺傳疾病，都可以利用嵌合體技術(shù)建立特定的動物模型。 艾滋病病毒不能感染小鼠，無法用小鼠作為研究艾滋病的模型動物。但是如果我們設(shè)法

8、讓小鼠長有人的免疫系統(tǒng)，艾滋病病毒就可以感染這種嵌合體小鼠，它們目前已被用于試驗治療艾滋病的藥物。,3.在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用,(1)人工制造有特殊經(jīng)濟價值的個體 對水紹、狐貍、絨鼠等毛皮動物，利用胚胎嵌合體技術(shù)可以獲得用交配或雜交法不能獲得的毛皮花色類型。 (2)種間移植 用于分析胎兒與母體的相互關(guān)系，如將斑馬的受精卵，移植到馬體內(nèi)生產(chǎn)斑馬（拯救珍稀瀕危動物）。,(3)可作為外源基因的導(dǎo)入方法 把外源目的基因先導(dǎo)入干細(xì)胞，再通過胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法將目的基因轉(zhuǎn)入胚胎，這是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中基因?qū)氲囊环N重要手段。 (4)生產(chǎn)移植器官 人兔胚胎嵌合體：將來發(fā)育成某種特定器官，如能克服免疫排斥反應(yīng)，有望用

9、于器官移植。,嵌合體的科研價值和醫(yī)學(xué)價值,如斯坦福大學(xué)魏斯曼實驗室最近向鼠胎注射進一些人神經(jīng)干細(xì)胞，制造出的小鼠大腦細(xì)胞中，摻雜有約1%為人腦細(xì)胞。 把人神經(jīng)干細(xì)胞注入鼠胎中，然后對不同發(fā)育階段的嵌合體鼠胎的腦進行解剖，就可以知道在胚胎發(fā)育過程人腦細(xì)胞是如何遷移的，從而有助于我們理解人腦的發(fā)育。,魏斯曼設(shè)想以后是否有可能制造出大腦全部由人腦細(xì)胞組成的小鼠，這才有了這樣的小鼠是否真的長著人腦、是否會像人那樣思考的可能，因而才有了倫理問題。 長著人的器官的嵌合體動物以后有可能被應(yīng)用于器官移植。,五、嵌合體研究存在的問題,（一）嵌合體組織器宮的特異抗原性 在種內(nèi)動物嵌合體制備過程中發(fā)現(xiàn)，不管是兩種胚

10、胎，還是多種胚胎制成的嵌合胚胎，細(xì)胞間均能協(xié)調(diào)的生長發(fā)育，不發(fā)生免疫排斥現(xiàn)象。但是，無論是進行供體-供體、供體-受體動物間，還是進行嵌合體-供體、嵌合體-受體動物間的組織或器官移植，均會發(fā)生強烈的免疫排斥反應(yīng)。,因此，嵌合組織并沒有因為成為嵌合體的一部分而改變免疫特性，而是在發(fā)育過程中，各自細(xì)胞的免疫抗原性表達(dá)可能被“掩蓋”，因而嵌合體中不同基因型組織之間或細(xì)胞之間并不發(fā)生排斥現(xiàn)象。而一旦離開嵌合體，其特異抗原性又表現(xiàn)出來。這為將來利用嵌合體生產(chǎn)人用器官造成了很大障礙,（二）種間嵌合體胚胎細(xì)胞分化、發(fā)育的局限性,不同種間的胚胎聚合形成嵌合體胚胎后，一種胚胎細(xì)胞 (供體)在另一種胚胎內(nèi)的存活、分

11、化和增殖會受到極大的限制。如大鼠和小鼠胚胎嵌合構(gòu)成的嵌合囊胚的組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，大鼠來源的細(xì)胞和小鼠來源的細(xì)胞，雖然都能參與滋養(yǎng)層和ICM的形成，但有傾向性。大鼠來源的細(xì)胞更多地構(gòu)成滋養(yǎng)層細(xì)胞，而小鼠來源的細(xì)胞更多地分化為ICM。而且，異種胚胎的細(xì)胞群并不混合，在任何場合都形成一定的群體。這一事實表明，卵裂球在嵌合胚中的移動是相當(dāng)受限的。對小鼠與琢鼠、不同的田鼠之間的種間嵌合體試驗也說明，不同基因型細(xì)胞的發(fā)育在不同組織器官中有區(qū)域性優(yōu)勢分布。,另外，綿羊和山羊嵌合體的產(chǎn)生，是嵌合體研究的重大突破。但綿、山羊的嵌合體大多于出生前死亡，反映了種間嵌合體細(xì)胞種細(xì)胞分化的限制性問題，也可能反映了不同種間

12、嵌合胚的發(fā)育與受體子宮的不協(xié)調(diào)關(guān)系，這主要來自以下3個方面的因素： 其一是受體胚胎細(xì)胞對供體細(xì)胞的排斥； 其二是兩種胚胎細(xì)胞在分化、發(fā)育和增殖方面的不協(xié)調(diào)性； 其三是受體子宮對嵌合胚胎內(nèi)異種胚胎的排斥。這些因素致使試驗中出現(xiàn)頻率較高的死胎、發(fā)育停滯或流產(chǎn)現(xiàn)象。,復(fù)習(xí)思考題,嵌合 嵌合體動物 嵌合體動物生產(chǎn)方法 囊胚顯微注射法 嵌合體動物應(yīng)用前景,未嫁接的西瓜不能連作，避免重茬， 主要就是為了防枯萎病。而采用西瓜嫁接栽培，可有效防止西瓜枯萎病、 流膠病等，不僅可以連作，而且耐寒、耐貧瘠、抗旱、抗?jié)竦哪芰Χ己?強，并且由于砧木根系發(fā)達(dá)，營養(yǎng)供給充足，苗子長勢好，可減少以氮 肥為主的化肥的施用量的3

13、0，產(chǎn)量還可提高30左右，畝產(chǎn)優(yōu)質(zhì)西 瓜40005000公斤,科學(xué)家將這項胚胎嵌合技術(shù)大多應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)動物模型等學(xué)科的研究。例如。利用這項技術(shù)可以檢測動物胚胎干細(xì)胞的全能性。 在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，胚胎嵌合技術(shù)也大有用武之地。例如，對水貂、狐貍、絨鼠等毛皮動物，利用這項技術(shù)可以得到按傳統(tǒng)的交配或雜交法無法得到的皮毛花色后代，從而提高毛皮的價值，克服動物間雜交繁殖的障礙，創(chuàng)造出新的物種。 同時，這項技術(shù)還可進行異種動物彼此妊娠產(chǎn)仔，加快珍稀動物的繁殖。 例如，利用其他動物代替大熊貓妊娠產(chǎn)仔，能夠加快它的繁殖速度。也可通過這項技術(shù)培育出含有人類細(xì)胞的豬，使得豬器官能用作人類器官移植之用

14、。亦可將外源基因?qū)胍环N細(xì)胞和胚胎相合，生下含有該外源基因的嵌合體動物，并可遺傳下去，使它具有重要的研究和應(yīng)用價值。 目前，科研人員已經(jīng)嵌合成功的嵌合體動物有小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬和牛等；種間嵌合體動物有大鼠小鼠嵌合體、綿羊山羊嵌合體、馬斑馬嵌合體、黃牛水牛嵌合體等。,將兩枚胚胎細(xì)胞 (同種或異種動物胚胎)融合共同發(fā)育成為一個胚胎為嵌合胚胎。將該胚胎移植給受體，妊娠產(chǎn)仔，如該仔畜具有以上兩種動物胚胎的細(xì)胞稱之為嵌合體動物。嵌合體一詞起源于希臘神話，它是指獅頭、羊身、龍尾的一種怪物。如同種類黑鼠和白鼠胚胎嵌合，生下黑白相間的花小鼠。不同種的綿羊和山羊胚胎細(xì)胞嵌合，可生下綿山羊，既有綿羊的特征。又有山羊的特征。該技術(shù)多應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)動物模型等科的研究。利用該項技術(shù)亦可檢測動物胚胎干細(xì)胞的全能性，即將胚胎干細(xì)胞和同種動物胚胎嵌合，如生下嵌合體，包括生殖系在內(nèi)組織細(xì)胞嵌合，即可確認(rèn)該干細(xì)胞具有全能性。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中亦具有重要意義，如對水貉、狐貍、絨鼠等毛皮動物，利用嵌合體可以得到按傳統(tǒng)的交配或雜交法不能得到的皮毛花色后代，提高毛皮的商品性能，可以克服動物間雜交繁殖障礙，創(chuàng)造出新的物種。亦設(shè)想利用