貝克曼流式細(xì)胞儀原理及軟件介紹

1、流式細(xì)胞儀FLOW CYTOMETER,原理及軟件介紹,Beckman Coulter流式細(xì)胞儀發(fā)展史,1947年Wallace Coulter發(fā)明了庫爾特原理，用于血細(xì)胞分析 1953年推出了世界上第一臺(tái)流式細(xì)胞分析儀Coulter Counter Model A 1972年推出世界上第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀EPICS II 1975年研制出世界上第一臺(tái)帶計(jì)算機(jī)的流式細(xì)胞儀 1997年推出世界上第一臺(tái)單激光四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀EPICS XL/MCL 2000年首先將高精度數(shù)字化顏色補(bǔ)償技術(shù)ADC（Advanced Digital Compensation）應(yīng)用于流式平臺(tái)，引領(lǐng)流式進(jìn)入全新的全矩

2、陣補(bǔ)償、全自動(dòng)補(bǔ)償和脫機(jī)補(bǔ)償時(shí)代 2003年推出世界上第一臺(tái)單激光五色的流式細(xì)胞儀FC500/MCL，2005年升級(jí)為FC500/MPL 2006年推出世界上第一臺(tái)具有EV參數(shù)同時(shí)進(jìn)行無成本絕對(duì)計(jì)數(shù)的多功能細(xì)胞分析系統(tǒng)Quanta SC， 將流式細(xì)胞術(shù)與庫爾特原理完美結(jié)合，2007年推出MPL進(jìn)樣系統(tǒng) 2007年收購Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成為高端流式市場(chǎng)的領(lǐng)導(dǎo)者 2009年，推出世界是第一臺(tái)三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀Gallios/Navios,EPICS XL-ADC,QUANTA SC,Cytomics FC500,Beckman Coulter Cel

3、llab Family,MoFlo XDP,Gallios/Navios,Cyan ADP,FC500硬件,What is flow cytometry?,流式細(xì)胞術(shù)是單個(gè)細(xì)胞/顆粒流過檢測(cè)裝置過程中，檢測(cè)到的物理和/或化學(xué)的特性。 Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition,分類,分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒 分選型：回收目標(biāo)細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。要求管道絕對(duì)無菌。,基本原理,流路（液流系統(tǒng)） 流動(dòng)室 鞘液SHEATH 樣本流SAMPLE 單細(xì)胞懸液5*1051*106個(gè)/ml 光路（光學(xué)系統(tǒng)） 光源 濾片 光電倍增管PMT

4、 HV 電路（電路系統(tǒng)） 放大電路HV及GAIN 增益 A/D轉(zhuǎn)換 分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī),液流系統(tǒng),流路構(gòu)造,流 路,單細(xì)胞懸液 大多數(shù)儀器是在50-300 m 大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中 這一過程,成為流體動(dòng)力學(xué)聚焦,FLOW CELL,光路系統(tǒng),光路構(gòu)造,光 路,光源 檢測(cè)信號(hào) 散射光信號(hào) FS: 前向角散射光 SS: 側(cè)向角散射光(90度散射光) 熒光信號(hào) 熒光染料 光學(xué)濾片,光 路,光源 與通過的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova3

5、00系列Innova70系列,常用激光器及其通道分配表,檢測(cè)信號(hào),散射光信號(hào)前向散射光(FS),FS-Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的檢測(cè)器, 為前向散射光檢測(cè)器 FS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關(guān) FS用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子的表面屬性 如:大小,前向散射光,前向散射光,散射光信號(hào) 側(cè)向散射光,SS-Side (Angel Light) Scatter 與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器, 也稱為90度散射光檢測(cè)器 SS用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少, 核質(zhì)比,側(cè)向散射光,側(cè)向散射光,

6、90 Degree Scatter,0,200,400,600,800,1000,8,15,20,30,40,50,100,200,1000,Lymphocytes,Monocytes,Neutrophils,Side Scatter Projection,Light Scatter Gating,Scale,光路-熒光信號(hào),每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長, 并激發(fā)后會(huì)有發(fā)射波長,流式細(xì)胞儀檢測(cè)的即是它特定的發(fā)射波長. 利用各種不同波長的光學(xué)濾片來收集(檢測(cè))這些光學(xué)信號(hào),熒光染料的特性,激發(fā)波長(EXCITING) 發(fā)射波長(EMISSION),常用熒光染料的特性,熒光染料 激發(fā)波長 (nm

7、) 發(fā)射波長(nm) 用途 顏色 FITC 488 525 免疫熒光 綠色 PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅 PeCy5 488 675 免疫熒光 紅 PI 488 620 DNA染色 橙紅 PECy7 488 755 免疫熒光 深紅 PerCP 488 670 APC 633 670,5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7,熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度) Q-Prep / ImmunoPrep 試劑系統(tǒng),PerCP APC FITC ECD PC5 PE,CD8-FITC,CD8-PE

8、,CD8-ECD,CD8-PC5,CD8-PerCP,CD8-APC,光路 - 濾片特性,長通濾片 允許長于設(shè)定波長的光通過 短通濾片 允許短于設(shè)定波長的光通過 帶通濾片 允許一定帶寬的波長通過,光路 - 濾片特性,當(dāng)以 45o 角放置濾片時(shí),該濾片可以通過一定波長的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長以下的光 這種方式的濾片稱為二向色性濾片( dichroic filter),濾片,帶通濾片 BAND PASS (BP) 只允許某些波長的光通過 二向色性濾片 DICHROIC FILTER 一定波長以上通過，該波長以下折射,630 nm BandPass Filter,Transmitted Light,White Light Source,620 -640 nm Light,Dichroic Filter/Mirror at 45 deg,電路系統(tǒng),Optics - Detectors,Photomultiplier tube (PMT) 將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號(hào),不同的脈沖信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程,Single Parame