一些抗氧化酶活性的測(cè)定

1、1、 SOD、POD、MDA和蛋白質(zhì)測(cè)定（1）酶液的提?。捎糜跍y(cè)定SOD、POD、MDA和蛋白質(zhì)）取0.5g樣品加5ml 0.05M（pH7.8）的磷酸緩沖液冰浴研磨（2ml磨樣，3ml沖洗）后轉(zhuǎn)入10ml離心管中，4，10000rpm離心20min，上清液即為酶液（2）SOD、POD、MDA和蛋白質(zhì)的測(cè)定 1 SOD活性測(cè)定（NBT法）試劑藥品：0.05M 磷酸緩沖液（pH7.8）；130mM 甲硫氨酸（Met）；750M氮藍(lán)四唑（NBT）；100M EDTA-2Na；20M 核黃素 3ml反應(yīng)體系1.5ml 0.05M（pH7.8）PBS0.3ml 130mM Met0.3ml 750M

2、 NBT0.3ml 100M EDTA-2Na50L酶液（光對(duì)照和暗對(duì)照以磷酸緩沖液代替酶液，酶液用量可自行調(diào)節(jié)，以吸光值在0.1-0.9間即可）0.25ml蒸餾水0.3ml 20M 核黃素 將1支暗對(duì)照管置暗處，其余樣品日光下（4000lx）反應(yīng)20min（時(shí)間可自行調(diào)節(jié)，反應(yīng)體系顏色變化即可）。以暗對(duì)昭作空白調(diào)零，測(cè)定光對(duì)照及樣品560nm處吸光值。 計(jì)算SOD活性（U/g）=（Ack-AE）VTD）/（0.5AckWVR）（SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位） Ack：光對(duì)照管吸光度 AE ：樣品管吸光度 VT：酶提取液總體積（ml） VR：測(cè)定時(shí)酶液用量（ml）

3、 W：樣品鮮重（g） D：稀釋倍數(shù)2 POD活性測(cè)定（愈創(chuàng)木酚法）試劑藥品：0.05M 磷酸緩沖液（pH5.5）；0.2%愈創(chuàng)木酚溶液；0.3% H2O2 3ml反應(yīng)體系1.0ml 0.3% H2O20.95ml 0.2%愈創(chuàng)木酚溶液1.0ml PBS（pH5.5）50L 酶液（酶液用量可自行調(diào)節(jié)，以吸光值在0.1-0.9間即可） 最后加入H2O2或愈創(chuàng)木酚啟動(dòng)反應(yīng)，可使反應(yīng)體系混合更均勻 以PBS pH5.5為對(duì)照調(diào)零，記錄470nm處吸光值（以每1min增加0.01定義為1個(gè)酶活性單位） POD活性（U/（gmin）=（A470VTD）/（0.01WVRt） A470：反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變

4、化 VT：總的酶液提取液體積（ml） D：稀釋倍數(shù) VR：測(cè)定時(shí)的酶液體積（ml） W：樣品鮮重（g） t：反應(yīng)時(shí)間（min）3 MDA含量測(cè)定（TBA法）試劑藥品：0.6% TBA 反應(yīng)體系：1ml提取液+2ml 0.6% TBA，沸水浴15min，冷卻離心，取上清在600,532,450nm下測(cè)定吸光值 MDA含量計(jì)算：反應(yīng)混合液中MDA濃度C（mol/L）=（6.45（A532-A600）-（0.56A450）提取液中MDA濃度（mol/ml）=（CMDA反應(yīng)液體積ml）/（測(cè)定時(shí)提取液用量ml1000）樣品中MDA含量（molg-1Fw）=（提取液中MDA濃度提取液總量ml）/植物組織

5、鮮重g4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)G-250法）試劑藥品：考馬斯亮藍(lán) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：參照植物生理生化試驗(yàn)原理和技術(shù)（王學(xué)奎版）191頁(yè) 提取液在室溫下放置0.5-1h以充分提取，5ml考馬斯亮藍(lán)+100L提取液（用量可調(diào)節(jié)），混勻，反應(yīng)2-5min后，在595nm下比色 蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合反應(yīng)十分迅速，在2min左右反應(yīng)達(dá)到平衡，其顏色可在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5-20min內(nèi)顏色的穩(wěn)定性最好 樣品中蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮質(zhì)量）=（XVTN）/（WVS1000） X：根據(jù)樣品的吸光度所查得的標(biāo)準(zhǔn)曲線值（蛋白質(zhì)質(zhì)量g） VT：提取液總體積ml W：樣品鮮質(zhì)量g VS：測(cè)定時(shí)加樣量m

6、l N：稀釋倍數(shù)2、 葉綠素含量的測(cè)定試劑藥品：95% 乙醇 取葉片0.1-0.2g，剪成小塊放入刻度試管，加95% 乙醇，于暗處放置12h，待葉片綠色褪盡，即可在665、649nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值 葉綠素含量計(jì)算： Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649-7.32A665 葉綠素含量（mg/g）=（CVN）/（W1000） C：葉綠素a+b含量（mg/L） V：提取液體積ml N：稀釋倍數(shù) W：樣品鮮質(zhì)量或干質(zhì)量g3、 GSH、AsA含量測(cè)定（1） 測(cè)定液的提取 取一定部位的植物葉片(視需要而定，去葉脈)0.5g剪碎加入5mL 5% 三氯乙酸(TCA)溶液，研磨

7、， 15000r/min離心10min，上清液定容至5mL。（2） GSH含量的測(cè)定試劑藥品：5%三氯乙酸（TCA）溶液；150mM NaH2PO4（pH7.7）溶液；100mM 磷酸緩沖液（pH6.8）；DTNB試劑（75.3mg DNTB溶于30ml 100mM pH6.8 PBS中） GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配置濃度分別為0mM、0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.10mM、0.12 mM的標(biāo)準(zhǔn)GSH溶液，吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液各0.25ml，分別加入150mM 的NaH2PO4（pH7.7）2.60ml，混合均勻后，往各管中加入DNTB試劑0.18ml，搖勻后，30保溫反

8、應(yīng)5min，測(cè)A412（以PBS代替DNTB試劑作空白對(duì)照）。將測(cè)定結(jié)果以GSH濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 GSH含量的測(cè)定：分別取上述樣品提取液0.25ml，各加入150mM NaH2PO4（pH7.7）2.6ml、DNTB試劑0.18ml，以加磷酸緩沖液代替DNTB試劑作空白。搖勻后，于30保溫反應(yīng)5min，測(cè)定412nm波長(zhǎng)下的光吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的GSH含量（GSH含量用g/gFW表示）。（3） AsA含量的測(cè)定試劑藥品：5% 三氯乙酸（TCA）溶液；150mM NaH2PO4（pH7.4）溶液；10% 三氯乙酸（TCA）溶液；44% H3PO4；4% 2,

9、2-二聯(lián)吡啶；3% FeCl3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取17.613mg的AsA，溶解并定容至100ml，得到1mM的標(biāo)準(zhǔn)母液，利用該標(biāo)準(zhǔn)母液分別配置濃度分別為0mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM的AsA溶液。吸取上述各標(biāo)準(zhǔn)液200L于編好號(hào)的對(duì)應(yīng)的不同試管中，分別往各管中加入150mM NaH2PO4 200L，H2O 200L，混合均勻，超過(guò)30s后再分別往各試管中加入10% TCA溶液400L、44% H3PO4 400L，4% 2,2-二聯(lián)吡啶400L，3% FeCl3 200L，混勻后在37水浴中保溫60min，然后測(cè)525nm處的O

10、D值，將測(cè)定結(jié)果以AsA濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 吸取上述制備好的樣品上清液0.2ml，分別加入150mM的NaH2PO4（pH7.4）0.2ml、H2O 0.2ml，混合均勻，至少30s后，再依次分別往各管中加入10% TCA 0.4ml，44% H3PO4 0.4ml，4% 2,2-二聯(lián)吡啶0.4ml和3% FeCl3 0.2ml，混合后在37水浴中保溫60min，然后測(cè)525nm處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中AsA的含量（AsA含量用g/gFW表示）。4、 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性的測(cè)定試劑藥品：0.05M PBS（pH7.8，7.0）；0.5mM As

11、A；0.1mM EDTA；0.1mM H2O2 APX酶液的制備：稱取0.5g材料剪碎，5ml緩沖液冰浴研磨，4，10000g離心20min 活性測(cè)定：在3個(gè)比色皿中各加入20L提取液，再加入3ml反應(yīng)液，1號(hào)比色皿中不加AsA和H2O2作為參照，2號(hào)比色皿中不加H2O2作為控制參照，3號(hào)比色皿中加入0.1mM H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，每10s連續(xù)記錄室溫下290nm吸光值的變化X。以室溫下每一分鐘氧化1mol AsA的酶量作為一個(gè)酶活性單位（U）。 計(jì)算活性U=（XVT1000601000）/（W2.8VR10）X：OD值的變化 VT：酶提取液總體積（ml） 1000：將ml轉(zhuǎn)換成L 60：將1m

12、in轉(zhuǎn)換成60s 1000：將mM轉(zhuǎn)換成mol W：鮮葉質(zhì)量g 2.8：吸光系數(shù)mM/L cm VR：測(cè)定時(shí)酶液用量（ml） 10：每10s記錄吸光值的變化部分常用試劑配制：1 磷酸緩沖液（PBS）： 母液：A液 Na2HPO412H2O 71.64g+蒸餾水溶解，定容至1000ml B液 NaH2PO42H2O 31.2g+蒸餾水溶解，定容至1000ml0.05M（1000ml）pHA液mlB液ml5.510.75239.257.0152.597.57.8228.7521.25 加H2O定容至1000ml2 測(cè)SOD用： 130mM Met（100ml）：稱1.9399g Met + pH

13、7.8 PBS定容至100ml 避光750M NBT（100ml）：稱0.06133g NBT + pH 7.8 PBS定容至100ml 100M EDTA-2Na（100ml）：稱0。g EDTA-2Na + pH 7.8 PBS定容至100ml 避光20M核黃素（1000ml）：稱0.00753g 核黃素 + H2O定容至1000ml3 測(cè)POD用： 0.3% H2O2（250ml）：吸2.5ml 30% H2O2 + pH 5.5 PBS 定容至250ml 0.2% 愈創(chuàng)木酚（250ml）：吸0.5ml 愈創(chuàng)木酚 + pH 5.5 PBS 定容至250ml4 測(cè)MDA用： 5% TCA（100ml）：稱5g TCA + H2O定容至100ml 10% TCA（100ml）：稱10g TCA + H2O定容至100ml 10% NaOH（10ml）：稱1g NaOH