纖維素酶和半纖維素酶市場(chǎng)調(diào)研報(bào)告

1、纖維素酶和半纖維素酶市場(chǎng)調(diào)研報(bào)告目錄第一章 纖維素酶和半纖維素酶概述 第一節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶定義 第二節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶概述 第二章 纖維素酶和半纖維素酶技術(shù)發(fā)展趨勢(shì) 第三章 纖維素酶和半纖維素酶國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)綜述 第一節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶市場(chǎng)狀況分析及預(yù)測(cè) 第二節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶產(chǎn)量分析及預(yù)測(cè) 第三節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶需求量分析及預(yù)測(cè) 第四節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶產(chǎn)供需狀況分析及預(yù)測(cè) 第五節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶價(jià)格分析 第六節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶進(jìn)出口狀況分析第四章 國(guó)內(nèi)纖維素酶和半纖維素酶生產(chǎn)廠家介紹 第五章 國(guó)內(nèi)纖維素酶和半纖維素酶擬建及在建項(xiàng)目 第六章 纖維素

2、酶和半纖維素酶經(jīng)銷商 第七章 國(guó)外纖維素酶和半纖維素酶市場(chǎng)分析 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 亞洲 歐盟 北美自由貿(mào)易區(qū) 第八章 國(guó)外纖維素酶和半纖維素酶生產(chǎn)商進(jìn)口商概述第一章 纖維素酶和半纖維素酶概述 第一節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶定義 纖維素酶(cellulase)是指能水解纖維素1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶總稱，它不是單一酶，而是起協(xié)同作用多組分酶系。纖維素酶由葡聚糖內(nèi)切酶(ec3.2.1.4，也稱cx酶)、葡聚糖外切酶(ec3.2.1、91，也稱c1酶)、葡萄糖苷酶(ec2.1.21，也稱cb酶或纖維二糖酶)三個(gè)主要成分組成的誘導(dǎo)型復(fù)合酶系。c1酶和cx酶主要溶解纖維素

3、，cb酶主要將纖維二糖、纖維三糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，當(dāng)三個(gè)主要成分的活性比例適當(dāng)時(shí)，就能協(xié)同作用完成對(duì)纖維素降解。其酶催化效率高，比一般酶高106-107倍；酶的催化反應(yīng)具高度專一性，酶對(duì)其作用底物有嚴(yán)格選擇性；催化反應(yīng)條件溫和；酶催化活力可被調(diào)節(jié)控制：無(wú)毒性。第二節(jié) 纖維素酶和半纖維素酶概述 纖維素酶應(yīng)用在畜牧業(yè)應(yīng)用 纖維素酶是畜牧業(yè)中一種新型飼料添加劑。利用纖維素酶(添加量一般在0.1%-0.3%)能將飼料中一部分難于消化纖維素轉(zhuǎn)化為糖和菌體蛋白，改進(jìn)動(dòng)物飼料利用性，能使畜禽最大限度利用飼料，減少飼料消耗，提高飼料利用價(jià)值，減少畜禽消化道疾病發(fā)生；同時(shí)可減少飼料用量，降低養(yǎng)殖成本。在食品工業(yè)應(yīng)用

4、 纖維素酶在食品工業(yè)應(yīng)用極為廣泛。如將纖維素酶應(yīng)用于豆腐生產(chǎn)工藝中，結(jié)果表明，在大豆浸漬時(shí)添加0.5%-5.0%纖維素酶，可提高4.00%-11.01%豆腐出品率，且所產(chǎn)豆腐色質(zhì)和風(fēng)味無(wú)明顯變化，同時(shí)不改變?cè)猩a(chǎn)工藝路線，其經(jīng)濟(jì)效益比較明顯。用纖維素酶處理茶葉制備速溶茶，可有效提高速溶茶提取率，具有一定穩(wěn)定性，制成速溶茶不僅保持茶葉天然的色、香、味和營(yíng)養(yǎng)成分，且無(wú)不溶性渣滓，飲用方便。纖維素酶應(yīng)用于果蔬榨汁、花粉飲料有利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲出、增加出汁率約10%、減少壓榨壓力、促進(jìn)汁液榨取和澄清作用。纖維素酶處理植物可使細(xì)胞壁發(fā)生不同程度改變，如軟化、膨脹和崩潰等，從而可提高細(xì)胞內(nèi)含物提取率，用于

5、處理大豆，不僅可促使其脫皮、增加從豆類中提取優(yōu)質(zhì)水溶性蛋白質(zhì)得率，且還可回收豆渣中蛋白質(zhì)和油脂。纖維素酶用于淀粉制造，可縮短時(shí)間，增加得率；還有報(bào)道稱，用纖維素酶結(jié)合現(xiàn)代工程技術(shù)可改善煙草品質(zhì)。 白酒釀造所用原料中纖維含量較大，使用纖維素酶后，可同時(shí)將淀粉和纖維素轉(zhuǎn)化為糖，再經(jīng)酵母分解全部轉(zhuǎn)化為酒精，提高3%-5%出酒率，且酒體質(zhì)量純正，淀粉和纖維利用率高達(dá)90%。纖維素酶用于固態(tài)無(wú)鹽醬油發(fā)酵，能將包裹蛋白質(zhì)的纖維素分解，使蛋白質(zhì)呈裸露狀態(tài)，便于蛋白酶分解蛋白質(zhì)，提高醬油得率，加快發(fā)酵速度，改善醬油風(fēng)味和質(zhì)量，酶制劑用量?jī)H為0.0125%，醬油中還原糖增加10.7%，色度提高4.2%，全氮和原

6、料利用率分別比不加纖維素酶提高8.6%和8.1%。在食醋釀造過(guò)程中，將纖維素酶與糖化酶混合使用，可明顯提高原料利用率和出品率；應(yīng)用于啤酒工業(yè)麥芽生產(chǎn)上，可增加麥粒溶解性、加快發(fā)芽、減少糖化液中葡萄糖含量，改進(jìn)過(guò)濾性能。在洗滌劑工業(yè)應(yīng)用 近年來(lái)，堿性纖維素酶在洗滌劑上應(yīng)用改變傳統(tǒng)去污機(jī)制。酸性纖維素酶對(duì)木質(zhì)素作用是一個(gè)糖化過(guò)程，在多種組分協(xié)同作用下能得到更多最終產(chǎn)物葡萄糖；而堿性纖維素酶是一種組分的內(nèi)切葡萄糖苷酶，主要與棉纖維中僅占10%左右非結(jié)晶區(qū)纖維素分子起作用，堿性纖維素酶可選擇性吸附在棉纖維非結(jié)晶區(qū)，使棉纖維膨松，水合纖維素分解，膠狀污垢脫落。沈雪亮等(2002)從廢紙漿中選育一株芽孢桿

7、菌，該菌產(chǎn)羧甲基纖維素酶能力很強(qiáng)，顯示重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，具有良好應(yīng)用前景。其它方面 纖維素酶在紡織、造紙、地質(zhì)鉆井等方面均有很大應(yīng)用潛力，利用纖維素酶對(duì)纖維織物進(jìn)行生物整理，經(jīng)纖維素酶整理的織物具有滑爽、布面清晰、懸垂性好、吸濕性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有一定的“絲光”效果。用纖維素酶適當(dāng)處理紙漿，能增加微細(xì)纖維生成量和提高保水度，有可能促進(jìn)某些紙張抗張力提高。此外，纖維素酶還應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)制消化劑等。另外，纖維素酶在草藥提取方面也有一定應(yīng)用。前景展望 纖維素是自然界中十分豐富資源，纖維素酶具有高效性和安全性，我國(guó)對(duì)纖維素酶的主要研究方向是用于食品和釀造領(lǐng)域。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，纖維素酶菌種產(chǎn)酶能力

8、和生產(chǎn)技術(shù)水平都有較大提高，90年代后建成一些纖維素酶生產(chǎn)廠，但由于菌種選育和生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)展不大、酶活力低、成本高，沒(méi)有形成大規(guī)模生產(chǎn)。鑒于目前存在的問(wèn)題，擬提出以下研究方向，進(jìn)一步加強(qiáng)纖維素酶作用機(jī)制研究。 (1)我國(guó)由于菌種選育進(jìn)展不大、酶活力低、產(chǎn)酶成本高，沒(méi)有形成大規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)加強(qiáng)菌種選育的基礎(chǔ)研究工作，以提高其產(chǎn)量和活性，特別是要注意利用基因重組技術(shù)選育出活性高、產(chǎn)酶量大的菌種。(2)目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)技術(shù)方法進(jìn)展不大，大多采用固體發(fā)酵法，成品纖維素酶的分離純化極為困難，外觀粗糙、質(zhì)量不穩(wěn)定，雜質(zhì)含量高，所以研究液體發(fā)酵具有實(shí)際意義。 (3)加強(qiáng)纖維素酶酶活檢測(cè)方法研究。雖現(xiàn)有纖維素酶酶活的

9、檢測(cè)方法很多，但真正能適合工業(yè)化檢測(cè)方法還沒(méi)有，給實(shí)際工作帶來(lái)困難，應(yīng)盡快制訂出統(tǒng)一檢測(cè)方法，供生產(chǎn)中應(yīng)用。 我國(guó)的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品資源豐富，使得利用這些農(nóng)作物秸稈等作為發(fā)酵底物進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵具有廣闊的發(fā)展前景，且可以充分利用資源。纖維素酶在飼料工業(yè)中的研究與應(yīng)用纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物，是地球上最為豐富的可再生性天然資源。liitzen等在1983年推算出纖維素的合成速率相當(dāng)于全人類每人每天70kg，這一結(jié)果足以顯示其對(duì)整個(gè)人類的價(jià)值所在。然而，植物纖維素的高聚合度、毛細(xì)管結(jié)構(gòu)、木質(zhì)素和半纖維素所形成的保護(hù)層及其超分子結(jié)構(gòu)中具有高結(jié)晶度(crystallinity index)的結(jié)

10、晶區(qū)存有大量氫鍵(包括分子鏈內(nèi)、鏈間及分子鏈與表面分子之間形成的氫鍵)造成纖維素難以被利用，目前約有80%未被開(kāi)發(fā)利用，具有極為誘人的前景。對(duì)纖維素的深入研究和利用必將是解決當(dāng)前許多國(guó)家面臨的糧食、飼料和能源短缺及環(huán)境污染等問(wèn)題的一條有效途徑；利用飼料生物技術(shù)及微生物發(fā)酵工程降解纖維素，達(dá)到資源有效利用的技術(shù)研究和成果轉(zhuǎn)化已成為21世紀(jì)各國(guó)共同關(guān)注的一項(xiàng)重大課題。為進(jìn)一步加快纖維素酶在飼料工業(yè)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究，現(xiàn)就關(guān)于利用纖維素酶降解纖維素，使其達(dá)到有效利用的研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景作一綜述。1 纖維素酶的分子生物學(xué) 纖維素酶是指所有參與降解纖維素最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖的各種酶的總稱。它是一類復(fù)雜的復(fù)合物，

11、故而又被稱為纖維素酶系(cellulase system)。1.1 能降解纖維素的微生物 自然界能降解纖維素的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌等。細(xì)菌類有紅黃纖維弧菌、普通纖維弧菌、瘤胃球菌和熒光極毛桿菌等；真菌類有黑曲菌、血紅栓菌、臥孔屬、疣孢漆斑菌qm460、繩狀青霉、變幻青霉、變色多空霉、ptuliopifera、乳齒耙菌、腐皮鐮孢、綠色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜熱毛殼菌qm9381和嗜熱子囊菌qm9383等； 放線菌綱有鏈霉屬qmb814、高溫放線菌屬和theremomonospora curvata等。1.2 纖維素酶的組分 不同種類的微生物所形成的纖維素酶系之間在組分和性質(zhì)上均有很大

12、的差異。從廣義角度分，纖維素酶系包括水解酶類、氧化酶類和磷酸化酶類。其中有苯醌脫氧酶、纖維二糖氧化酶/氫化酶、乳酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、外切葡萄糖水解酶/外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、纖維二糖磷酸化酶、纖維糊精磷酸化酶和纖維二糖差向異構(gòu)酶。從狹義的角度分，纖維素酶系僅僅包括內(nèi)切葡聚糖酶(簡(jiǎn)稱c1或eg)，纖維二糖水解酶(簡(jiǎn)稱cx或cbh)和葡萄糖苷酶(簡(jiǎn)稱bg)三種水解酶，因只要這三種酶共同作用就可以將纖維素徹底水解為葡萄糖，故被研究者形象地稱為“完全”纖維素酶系(“complate” cellulase system)。2 纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理2.1 纖維素酶的分子結(jié)構(gòu) 借助

13、現(xiàn)代化分析技術(shù)和方法，如重組dna、電鏡和x射線掃描、作用位點(diǎn)修飾和點(diǎn)誘變、局部蛋白水解、親和色譜分離、在特性和配體結(jié)合研究方面的人工基質(zhì)的采用等，人們對(duì)纖維素酶分子結(jié)構(gòu)的研究工作開(kāi)展了廣泛的工作。迄今為止，一級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被分析確定的纖維素酶至少有20種。通過(guò)比較分析，人們發(fā)現(xiàn)許多不同纖維素酶間表現(xiàn)出一定的同源性(homology，也稱保守性)；作用于-底物的酶盡管它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上無(wú)同源性或同源程度很低，但三級(jí)結(jié)構(gòu)上仍有可能表現(xiàn)較大同源性。研究還證實(shí)，絕大多數(shù)真菌(如tteesi)和一些細(xì)菌(如c.fimi)所產(chǎn)生的纖維素酶為糖蛋白，而糖基化的程度取決于酶和菌的種類，范圍從極小到約為酶重的90%

14、。到目前的一些研究表明，糖基化在穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，提高熱穩(wěn)定性，抵抗蛋白酶解或變性以及促進(jìn)酶分泌和底物識(shí)別方面均有一定作用。2.2 纖維素酶系各組分間的協(xié)同作用及酶解機(jī)理2.2.1 “完全”纖維素酶系三種酶組分的水解作用及對(duì)不同基質(zhì)的作用能力見(jiàn)表。2.2.2 纖維素酶系的酶解機(jī)理 通常認(rèn)為，纖維素酶系主要包括c1酶、c2酶和葡萄糖苷酶。一般規(guī)律，c1酶主要作用于天然纖維素，將其轉(zhuǎn)變成水合非結(jié)晶纖維素，而對(duì)結(jié)晶纖維素（如棉花和微晶纖維素）無(wú)活性，但可水解非結(jié)晶纖維聚和可溶性底物(如羧甲基纖維素鈉)，纖維低聚糖也是其底物，其水解速率隨鏈的加長(zhǎng)而加快。c1酶又可分為cx1酶和cx2酶。cx1酶是內(nèi)斷型

15、纖維素酶，它從水合非結(jié)晶纖維素分子內(nèi)部作用于1，4糖苷鍵，生成纖維素糊精和纖維二糖；cx2酶為外斷型纖維素酶，它從水合非結(jié)晶纖維素分子的非還原性末端作用于1，4葡萄糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子。葡萄糖苷酶，又稱纖維二糖酶，它作用于纖維二糖生成葡萄糖。這些酶協(xié)同作用可將纖維素徹底降解為葡萄糖。 纖維素酶可破解富含纖維素的細(xì)胞壁，使其包含的蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái)并加以利用，同時(shí)又可將纖維降解為可被畜禽機(jī)體消化吸收的葡萄糖，從而提高飼料利用率。2.2.3 纖維素酶系的作用 (1)補(bǔ)充同源酶的不足，促進(jìn)動(dòng)物消化吸收，提高飼料利用率。由于動(dòng)物生理上的差異，不同動(dòng)物消化道中酶系不同，數(shù)量也很有

16、限，再加上在消化道中停留時(shí)間短，酶的催化作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有發(fā)揮出來(lái)，飼料未被充分消化吸收而被排出體外，造成浪費(fèi)。添加纖維素酶可提高動(dòng)物對(duì)粗纖維的利用率。同時(shí)可改善單胃動(dòng)物消化道環(huán)境，激活胃蛋白酶。(2)摧毀植物細(xì)胞壁，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)更好地被吸收利用。纖維素酶，半纖維素酶，果膠酶的協(xié)同作用，破壞植物細(xì)胞壁，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái)，增加動(dòng)物對(duì)植物原料的利用率。(3)消除抗?fàn)I養(yǎng)因素，促進(jìn)動(dòng)物健康成長(zhǎng)。半纖維素和果膠部分溶于水后產(chǎn)生粘性溶液，增加消化道的粘度，對(duì)內(nèi)源酶造成障礙，而添加纖維素酶可降低粘度，增加內(nèi)源酶的擴(kuò)散，提高酶與養(yǎng)分接觸面積，促進(jìn)飼料的良好消化，提高動(dòng)物健康水平。（4）利于發(fā)揮酶的協(xié)同催化作用。大量

17、研究證實(shí)，復(fù)合酶的效果優(yōu)于單一酶，酶的合理搭配又有利于發(fā)揮整體效應(yīng)。3 影響纖維素酶系作用的因素 31 溫度對(duì)纖維素酶解的影響 在纖維素酶解反應(yīng)中，溫度是一個(gè)很重要的影響因素，它不僅影響反應(yīng)速度，而且影響纖維素的活性。一方面，當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度加快，有利于纖維素酶解的進(jìn)行；另一方面，隨著溫度升高而使酶蛋白逐步變性，反應(yīng)速度隨之下降。因此，酶反應(yīng)存在一個(gè)最適溫度，如bgase最適溫度為70；而c1酶為42；fpa酶活是c1酶、cmcase和bgase的綜合酶活，最適溫度為50。不論是天然纖維素還是氣爆麥草最佳水解溫度為50，纖維素酶解率在4550最大。3.2 ph值對(duì)纖維素酶解的影響 由于p

18、h值的改變可破壞酶空間構(gòu)象，引起酶活的損失，還能影響酶活性中心催化基團(tuán)的解離，使底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物過(guò)程受影響；同時(shí)ph值的改變影響酶活性中心結(jié)合基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物解離狀態(tài)，使底物不能與其結(jié)合，或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。因此，纖維素酶同樣存在最適ph值。如c1酶和bgase酶最適ph值為5.0，而cmcase要求的ph值較低些。3.3 底物濃度對(duì)纖維素酶解的影響 酶和底物的作用是通過(guò)酶和底物生成復(fù)合物進(jìn)行的，底物濃度與酶解速度關(guān)系符合米氏酶促動(dòng)力學(xué)方程。在一定溫度、ph值及酶濃度條件下，底物濃度對(duì)酶的催化反應(yīng)速度產(chǎn)生影響：當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，酶活性中心未被飽和，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而迅速增加；底物濃

19、度繼續(xù)增加時(shí)，反應(yīng)速度增加率就比較小，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾又聊撤N程度時(shí)，酶的活性中心被飽和或趨于飽和，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值，此后即使再增加底物濃度，反應(yīng)速度增加較小或不再增加，同時(shí)會(huì)增加酶解反應(yīng)的不均一性。3.4 纖維素酶用量對(duì)纖維素酶解的影響 一定量的纖維素在一定的粉碎程度下，纖維素分子能和酶分子結(jié)合到結(jié)合點(diǎn)的數(shù)量是有限的，當(dāng)這些結(jié)合點(diǎn)全部被纖維素酶分子占據(jù)后再增加纖維素酶的用量，新增加那部分酶分子無(wú)法和纖維素分子結(jié)合，因此起不到酶解作用。從經(jīng)濟(jì)的角度講，酶用量要盡可能的少。3.5 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶解的影響 半纖維素和木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的可及性影響降低纖維素酶向纖維素的擴(kuò)散速度，因?yàn)槔w維素酶不僅降

20、解纖維素的表面，而且還要向纖維素內(nèi)部擴(kuò)散，因而降低酶解速度；另外，半纖維素及木質(zhì)素具有無(wú)效吸附作用，使纖維素酶量增加；木質(zhì)素起屏蔽作用，木質(zhì)素含量越高屏蔽作用越大，從而降低了酶解率。4 纖維素酶在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用 纖維素酶作為飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，它的使用方法有體外酶解法和體內(nèi)酶解法兩種。前者因?yàn)橘M(fèi)工費(fèi)時(shí)和成本較高的缺點(diǎn)而研究較少。后者相對(duì)簡(jiǎn)單易行，目前正受到研究者的普遍采用，并先后對(duì)反芻獸、單胃動(dòng)物(肉雞、蛋雞、豬等)進(jìn)行了飼喂試驗(yàn)。4.1 纖維素酶在反芻動(dòng)物中的應(yīng)用 尹清強(qiáng)等在黑白花奶牛日糧中添加纖維素酶50g/頭天，產(chǎn)奶量提高8.9%；吳明樓以奶牛為研究對(duì)象得出了纖維素酶提高奶產(chǎn)量并對(duì)奶

21、質(zhì)無(wú)影響得結(jié)果。尹清強(qiáng)等在綿羊日糧中添加纖維素酶30 g/頭天，使處于牧草豐盛期和枯萎期的綿羊日增重分別提高153.41%和4.91%，同時(shí)還使羊毛產(chǎn)量提高5.04%，陳俠甫等在梅花鹿試驗(yàn)中也有類似報(bào)道。4.2 纖維素酶在單胃動(dòng)物中的應(yīng)用 單胃動(dòng)物不能分泌斷裂1，4糖苷鍵的內(nèi)源酶，除腸道中的微生物可以降解部分纖維素外，飼料中的纖維素對(duì)單胃動(dòng)物而言幾乎不具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。并由于纖維素的交錯(cuò)、纏繞和粘附，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收并影響腸道微生物菌群的平衡。因此在單胃動(dòng)物日糧中添加纖維素酶具有營(yíng)養(yǎng)和保健的雙重功效。4.2.1 肉雞 尹清強(qiáng)等(1993)在日糧中添加纖維素酶飼喂肉雞可使肉雞飼料消耗下降16

22、.25%，體重增加2.88%，料肉比降低10.18%；日本學(xué)者將0.2%的纖維素酶加入肉雞日糧中，以及秦江帆等進(jìn)行的相關(guān)試驗(yàn)，均得出類似結(jié)果。4.2.2 蛋雞 王懷凡等(1995)在蛋雞常規(guī)飼料中添加0.1%的復(fù)合纖維素酶，試驗(yàn)組的產(chǎn)蛋率比對(duì)照組提高10.8%，蛋重提高1.7%，料蛋比下降14.6%；徐奇支等(1998)在蛋雞飼料中添加0.1%和0.5%的纖維素酶降低了破蛋率。4.2.3 豬 王堯等(1995)用前期含草粉10%、后期含草粉15%的日糧添加纖維素酶飼喂肥育豬，試驗(yàn)組比對(duì)照組日增重提高0.255kg，料肉比下降0.24，每頭每日增加效益0.95元。4.3 應(yīng)用中存在的問(wèn)題 纖維素

23、酶作為一種飼料添加劑，對(duì)于畜禽取得了不同程度的促增長(zhǎng)效果，同時(shí)在草食家畜胃腸道疾病的治療方面也有一定的應(yīng)用。但目前在應(yīng)用和研究方面還存在一些問(wèn)題。如：(1)缺乏纖維素酶對(duì)畜禽生理機(jī)能的影響和毒性研究；(2)如何解決纖維素酶最適作用條件與動(dòng)物機(jī)體消化道內(nèi)環(huán)境的差異，如何延長(zhǎng)纖維素酶在體內(nèi)存留時(shí)間以充分發(fā)揮其酶解效力；（3）纖維素酶添加方式對(duì)酶活的影響，纖維素酶對(duì)不同種類、不同發(fā)育階段動(dòng)物消化道酶系的影響，添加纖維素酶后飼料配比如何改變，以及如何針對(duì)不同動(dòng)物改變纖維素酶系的組成；(4)有關(guān)混合酶制劑的研究。等等均需深入研究。5 結(jié)束語(yǔ) 綜上所述，纖維素酶在飼料工業(yè)的應(yīng)用前景非常廣闊。我國(guó)經(jīng)過(guò)近幾年

24、的研究發(fā)展已形成一定的規(guī)模，但是與國(guó)外畜牧先進(jìn)國(guó)家相比，飼料生物技術(shù)在纖維素的開(kāi)發(fā)利用方面還非常落后，今后就纖維素酶在我國(guó)飼料工業(yè)上的應(yīng)用要特別注意一下幾個(gè)問(wèn)題：要加大科技投入，加強(qiáng)生產(chǎn)與應(yīng)用方面的技術(shù)合作；要加強(qiáng)產(chǎn)纖維素酶的菌種選育和發(fā)酵提取工藝等基礎(chǔ)研究工作；要加強(qiáng)纖維素酶在飼料工業(yè)上應(yīng)用的作用機(jī)理研究，規(guī)范飼用酶制劑生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法；要盡快制定國(guó)內(nèi)統(tǒng)一的纖維素酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法。纖維素酶及其在紡織上的應(yīng)用1 引言纖維素是世界上蘊(yùn)藏量最豐富的天然高分子化合物，絕大多數(shù)由綠色植物通過(guò)光合作用合成。微生物對(duì)纖維素的降解、轉(zhuǎn)化是自然界中碳素轉(zhuǎn)化的主要環(huán)節(jié)。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的多組

25、分酶的總稱。目前，纖維素酶產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于紡織、飼料、釀造、制藥、造紙等行業(yè)，尤其是在紡織行業(yè)的應(yīng)用范圍目前正在不斷擴(kuò)大。2 纖維素酶纖維素酶的研究最早是1906年seilliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)了分解纖維素的纖維素酶。纖維素酶是能水解纖維素-1，4-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單一酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系。纖維素酶的來(lái)源非常廣泛，昆蟲、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物、細(xì)菌、放線菌和真菌等都能產(chǎn)生纖維素酶。主要的有：康氏木霉、里氏木霉、黑曲霉、斜臥青霉、芽孢桿菌等。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，而嗜堿細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶在堿性范

26、圍起作用。纖維素酶分子是由球狀的催化結(jié)構(gòu)域（cd）通過(guò)一個(gè)富含脯氨酸或羥基氨基酸的連接橋（linker）和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cbd）三部分組成。連接橋的作用可能是保持cd和cbd之間的距離。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域執(zhí)行著調(diào)節(jié)酶對(duì)可溶和非可溶性底物專一性活力的作用，對(duì)酶的催化活力是非常必需的。催化作用域的三維結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，對(duì)酶的催化活力起決定作用。3 纖維素酶對(duì)纖維素的作用機(jī)理目前，一種理論認(rèn)為：纖維素酶水解纖維素是-1，4-內(nèi)切葡聚糖（纖維二糖水解）酶（eg，endo-glucanase）,-1,4-外切葡聚糖（纖維二糖水解）酶（cbh,cellobiohydrolase）和-葡萄糖苷酶（bg, -g

27、lucosidase）協(xié)同作用下進(jìn)行的。首先，eg酶隨機(jī)水解切斷無(wú)定型區(qū)的纖維素分子鏈，使結(jié)晶纖維素出現(xiàn)更多的纖維素分子基端，為cbh酶水解纖維素創(chuàng)造條件，cbh酶的水解產(chǎn)物纖維二糖則由bg酶水解成葡萄糖，因而纖維素酶水解纖維素的過(guò)程可以簡(jiǎn)單表示為：egcbhbg。目前的研究表明，eg酶實(shí)際上至少包括eg、 eg、 eg和 eg四種，cbh至少包括cbh和cbh兩種。另外一種理論認(rèn)為：纖維素酶是由葡聚糖內(nèi)切酶（cx酶）、葡聚糖外切酶（c1酶）、-葡萄糖苷酶三個(gè)主要成分所組成的誘導(dǎo)型復(fù)合酶系。其中c1酶起水化作用，它作用于不溶性的固體表面，使形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)的纖維素鏈開(kāi)裂，長(zhǎng)鏈分子的末端部分游離，從

28、而使纖維素鏈易于水化。cx酶隨機(jī)水解非結(jié)晶纖維素、可溶性纖維素衍生物和葡萄糖的-1,4-寡聚物，葡萄糖苷酶將纖維二糖和纖維三糖水解成葡萄糖。該假說(shuō)的基本降解模式如下：結(jié)晶纖維素-c1無(wú)定形纖維素-cx纖維二糖-葡萄糖苷酶葡萄糖此外，coughlan認(rèn)為結(jié)晶纖維素的降解是一個(gè)多步驟過(guò)程，并認(rèn)為原初反應(yīng)即無(wú)序反映（amorphogenesis）使纖維素的結(jié)晶狀態(tài)發(fā)生改變，便于隨后的纖維素水解。還有學(xué)者認(rèn)為纖維素的降解中存在短纖維形成現(xiàn)象，他們認(rèn)為天然纖維素首先在一種非水解性質(zhì)的解鏈因子或解氫鍵酶作用下，使纖維素鏈內(nèi)或鏈間的氫鍵打開(kāi)，從而形成短纖維。4 纖維素酶在紡織上的應(yīng)用纖維素酶在染整上得到了廣

29、泛的應(yīng)用，特別在棉織物整理上，經(jīng)過(guò)纖維素酶整理后，棉織物的手感和外觀獲得很大的改善，因?yàn)榭椢锉砻娴慕q毛被除去，處理后織物更光潔，顏色更鮮艷。根據(jù)處理的目的不同，可進(jìn)行生化拋光、柔軟滑爽、改善光澤以及石磨水洗等加工。4.1 減量處理纖維素纖維織物用纖維素酶處理都伴隨著纖維的減量或失重，并引起許多性能變化。減量處理主要是改善織物的柔軟、彈性和懸垂性。減量加工大多數(shù)采用液體染色機(jī)和水洗機(jī)。若織物被減量過(guò)大，纖維的強(qiáng)度會(huì)受到損傷。棉織物的失重率一般控制在3%-5%范圍為好。棉織物經(jīng)過(guò)纖維素酶整理后，手感和外觀可以有很大的改善。因?yàn)榭椢锉砻娴慕q毛被去除，處理后的織物更光潔、顏色更鮮艷?？椢锏挠餐Χ群蛣傂?/p>

30、降低，光滑度和懸垂性提高，使織物獲得更好的手感。lee g.snyder的研究證實(shí)，纖維素酶能夠象燒毛一樣使織物的外觀變的光潔。c.l.chong等人的研究表明在織物的外感和手感被改善的同時(shí)，劇烈的機(jī)械攪拌和摩擦作用會(huì)加劇織物的強(qiáng)力損失。因此在保證處理效果的同時(shí)，避免織物強(qiáng)力過(guò)度損失就顯得非常重要。4.2 生物拋光處理生物拋光是一種用纖維素酶改善棉織物表面的整理工藝，以達(dá)到持久的抗起毛起球并增加織物的光潔度和柔軟度。天然纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)晶度高，在一定酶濃度和時(shí)間條件下很難把纖維素完全水解成葡萄糖單體，僅對(duì)織物表面或伸出織物表面的茸毛狀短小纖維作用。生物拋光也就是去除從纖維表面伸出的細(xì)微纖維

31、，經(jīng)纖維素酶處理后稍經(jīng)機(jī)械加工就可以得到表面平滑而茸毛少的織物。生物拋光的主要功效是使服裝和面料長(zhǎng)久保持光鮮、手感更柔軟。與傳統(tǒng)的加工方法比，生物拋光有如下優(yōu)點(diǎn)：織物表面更光潔無(wú)茸毛；織物表面顯得更加均勻；減少起毛起球的趨向；增加懸垂性并具滑爽手感；處理的織物更具有環(huán)保意義。經(jīng)過(guò)生物拋光處理的織物還有諸多優(yōu)點(diǎn)：穿著洗滌不易起球，染色鮮艷，保色保新時(shí)間長(zhǎng)，尤其對(duì)印花織物效果更好。4.3 水洗和石磨處理纖維素酶還廣泛應(yīng)用于牛仔褲產(chǎn)品的洗滌加工，代替石洗加工工藝。最早應(yīng)用在靛藍(lán)牛仔服裝的洗滌整理上，以獲得與石磨相同的染料脫色，洗白等褪色防舊效果。這種加工的原理是，首先將牛仔服裝上的漿料充分去除，充分

32、發(fā)揮纖維素酶對(duì)牛仔服裝表面的剝蝕作用；纖維素酶僅對(duì)牛仔服裝表面部分水解，造成纖維在洗滌時(shí)發(fā)生脫落，在纖維素酶處理時(shí)，牛仔服裝在轉(zhuǎn)鼓中不斷發(fā)生摩擦，加速服裝表面纖維的脫落，并使吸附在纖維表面的靛藍(lán)等染料一起去除，產(chǎn)生石磨洗滌的效果，并具有獨(dú)特的外觀和柔軟的手感。目前應(yīng)用的纖維素酶大多為中性或酸性纖維素酶。纖維素酶用于牛仔服裝水洗石磨加工，加工后的服裝雪花點(diǎn)多、立體感強(qiáng)、色光好；與傳統(tǒng)的石磨工藝相比，酶洗工藝條件溫和，耗能降低，減少了服裝和設(shè)備的磨損，水洗效率高；與傳統(tǒng)的化學(xué)助劑整理工藝相比，酶洗工藝大大減少了污水排放，有利于環(huán)境保護(hù)。4.4 其它處理除上述處理外，纖維素酶還與脂肪酶、果膠酶共同應(yīng)

33、用于棉織物的精練加工，去除棉纖維中的天然雜質(zhì)，為后續(xù)染色、印花和整理加工創(chuàng)造條件。酶精練后的織物潤(rùn)濕性、強(qiáng)度保留率與堿精練相同，失重率較少，耗水率低。纖維素酶整理也用于粘膠、lyocell和醋酸纖維織物，能改善織物的手感、懸垂性，去除織物表面的絨毛，減少了粘膠織物的起球傾向和lyocell織物的原纖化傾向。苧麻織物存在手感粗糙性差、穿著刺癢感問(wèn)題，嚴(yán)重影響了苧麻織物的服用性能，通過(guò)纖維素酶減量整理，能夠使織物獲得柔軟的手感和光潔的布面，刺癢感消失或改善。纖維素酶是多種酶的混合物，酶成分的表征對(duì)于了解和控制酶整理的效果是必不可的。從目前研究結(jié)果看，eg酶在減量處理、生物拋光處理、水洗和石磨處理性

34、能均十分優(yōu)良，是非常重要的纖維素酶組分。同時(shí)，溫度、ph值、表面活性劑、無(wú)機(jī)鹽、攪拌等因素都會(huì)影響纖維素酶處理的效果。因此，對(duì)不同的纖維素酶品種，不同的纖維要選擇合理的工藝條件，才能使酶處理的效果最佳。5 結(jié)束語(yǔ)纖維素酶處理具有環(huán)保、節(jié)能、高效等特點(diǎn)，符合可持續(xù)發(fā)展的要求，有利于綠色紡織、綠色染整，在紡織中具有廣闊的發(fā)展前景。纖維素酶在纖維改性加工中不僅要求高效，而且要求對(duì)纖維的損傷小，因此開(kāi)發(fā)紡織專用纖維素酶和降低酶制劑成本成為今后纖維素酶研究和開(kāi)發(fā)的重要方向。隨著分子生物學(xué)、遺傳工程的迅猛發(fā)展，國(guó)內(nèi)外均在嘗試應(yīng)用基因工程技術(shù)來(lái)改造和構(gòu)建高效纖維素降解菌，這將擴(kuò)大了纖維素酶的應(yīng)用范圍，使纖維

35、素酶更加廣泛的應(yīng)用在對(duì)纖維素纖維織物的改性加工中。第二章 纖維素酶和半纖維素酶技術(shù)發(fā)展趨勢(shì) 1纖維素酶制備工藝1. 1 產(chǎn)酶菌及菌種選育 纖維素酶來(lái)源非常廣泛，昆蟲、微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等)都能產(chǎn)生纖維素酶，通過(guò)微生物發(fā)酵方法是大規(guī)模制備纖維素酶有效途徑。由于放線菌的纖維素酶產(chǎn)量極低，研究很少。細(xì)菌的產(chǎn)量也不高，主要是葡聚糖內(nèi)切酶，且大多數(shù)對(duì)結(jié)晶纖維素沒(méi)有活性，所產(chǎn)生酶是胞內(nèi)酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到細(xì)胞外，增加提取純化難度，在工業(yè)上很少應(yīng)用。而絲狀真菌具有產(chǎn)酶諸多優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生纖維素酶為胞外酶，便于酶的分離和提?。划a(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較為合理；同時(shí)可產(chǎn)生許多半纖維素酶、

36、果膠酶、淀粉酶等。從纖維素酶工業(yè)化制備及其應(yīng)用角度看，研究和采用絲狀真菌產(chǎn)酶具有更大意義。從目前研究進(jìn)展來(lái)看，里氏木霉同時(shí)具有較為穩(wěn)定性狀、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)纖維素酶的能力和較好“抗代謝阻遏”能力，被認(rèn)為是最具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值菌株。制備過(guò)程中優(yōu)良菌株的選擇是前提和關(guān)鍵之一，是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ)性工作，國(guó)內(nèi)外專家對(duì)此進(jìn)行大量研究，青島海洋大學(xué)管斌等 (2002)通過(guò)利用紫外線、亞硝基胍等對(duì)里氏木霉進(jìn)行誘變處理，采用低劑量、反復(fù)多次復(fù)合誘變處理方法，用“以2脫氧葡萄糖作為降解產(chǎn)物阻遏物”高效篩選方法，選育得到一株抗分解代謝阻遏的突變株，使纖維素酶活力提高三倍。中科院微生物研究所董志揚(yáng)等 (2000)用康寧木霉

37、通過(guò)射線照射和亞硝基胍交替處理，誘變出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株t801，與出發(fā)菌株相比，其產(chǎn)酶能力提高1.77倍。張苓花等 (1998)采用康寧木霉w925、j931，經(jīng)過(guò)濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線(15w、30cm、2min)復(fù)合誘變得到產(chǎn)酶活性高的菌種，該菌種糖化力達(dá)到2，975，濾紙酶活達(dá)到531，比出發(fā)菌株分別提高100%和81%。1.2 生產(chǎn)方式 纖維素酶的發(fā)酵工藝有兩種：即固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。1.2.1固體發(fā)酵法 固體發(fā)酵法是以玉米等農(nóng)作物秸稈為主要原料，通過(guò)接種微生物進(jìn)行發(fā)酵工藝；具有投資少、工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品價(jià)格低廉優(yōu)點(diǎn)。但固體發(fā)酵法存在著根本缺陷，其生產(chǎn)纖維素酶很難提取、精制。由于

38、技術(shù)上困難，目前國(guó)內(nèi)絕大部分纖維素酶生產(chǎn)廠家均采用該技術(shù)生產(chǎn)纖維素酶，采取直接干燥粉碎得到固體酶制劑或用水浸泡后壓濾得到液體酶制劑，這樣得到產(chǎn)品外觀粗糙，質(zhì)量不穩(wěn)定，雜質(zhì)含量高。因此，隨著液體發(fā)酵酶制劑工藝發(fā)展及菌種性能提高，采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶勢(shì)在必行。1.2.2 液體發(fā)酵法 液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝過(guò)程是將玉米秸稈粉碎至20目以下進(jìn)行滅菌處理，然后送發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，同時(shí)接入纖維素酶菌種，發(fā)酵時(shí)間約為70h，溫度控制低于60。從發(fā)酵罐底部通入凈化后無(wú)菌空氣對(duì)物料進(jìn)行氣流攪拌，發(fā)酵完物料經(jīng)壓濾機(jī)壓濾、超濾濃縮和噴霧干燥后得到纖維素酶產(chǎn)品。液體發(fā)酵雖有發(fā)酵動(dòng)力消耗大、設(shè)備要求高等缺點(diǎn)；但液體發(fā)酵原料

39、利用率高、生產(chǎn)條件易控制、產(chǎn)量高、工人勞動(dòng)強(qiáng)度小、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)又使該方法成為發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶必然趨勢(shì)。1.3 發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶量和酶活力影響1.3.1 菌種 對(duì)于產(chǎn)酶菌種一般必須符合以下條件：一不是致病菌；二是能夠利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短，產(chǎn)酶量高；三是菌種不易變異退化，不易感染噬菌體；四是最好選用產(chǎn)生胞外酶菌種，有利于酶的分離，回收率高；此外，用于醫(yī)藥和食品上還要考慮安全問(wèn)題。纖維素酶菌種易退化，退化后產(chǎn)酶力明顯降低原因可能有三：(1)經(jīng)誘變篩選菌種發(fā)生回復(fù)突變；(2)自然負(fù)突變；(3)菌種長(zhǎng)時(shí)間低溫斜面保藏會(huì)在分生孢子上長(zhǎng)出次生菌絲，次生菌絲所形成分生孢子生命力強(qiáng)。1.3

40、.2 溫度 發(fā)酵溫度變化主要隨微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度變化而變化。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收熱量大于分解反應(yīng)放出熱量，發(fā)酵液需升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時(shí)，發(fā)酵液溫度自行上升，加上通風(fēng)攪拌帶來(lái)的熱量，這時(shí)發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶所需溫度。1.3.3 ph值 發(fā)酵過(guò)程中，微生物不斷分解和同化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與ph值有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液ph值在不斷變化，要根據(jù)其變化進(jìn)行控制。1.3.4 通風(fēng)量 通風(fēng)量多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中溶解氧而定。一般在發(fā)酵初期，菌體少，相對(duì)通風(fēng)量可以少些；菌體生長(zhǎng)旺盛時(shí)耗氧多，通風(fēng)量要大些；產(chǎn)酶旺盛時(shí)需強(qiáng)烈通風(fēng)。1.3.5 攪拌 對(duì)于

41、纖維素酶液體深層發(fā)酵，除需要通氣外，還需要攪拌，以利于熱交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于酶的生成；同時(shí)也可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，從而提高溶氧量，增加空氣利用。1.3.6 泡沫 發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多泡沫，其存在阻礙c02排除，影響溶氧量。生產(chǎn)上一般采用消泡劑，主要是一些天然礦物油類、醇類、脂肪酸類、酰類、酰胺類、醚類等。我國(guó)常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚)消泡。1.3.7 濕度 用固體培養(yǎng)法生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。 除此之外，主要營(yíng)養(yǎng)源、誘導(dǎo)劑、表面活性劑等也影響纖維素酶產(chǎn)量，因此摸索出一條適宜技術(shù)

42、路線是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)。王成華等 (1997)研究經(jīng)誘變選育里氏木霉913產(chǎn)酶條件，結(jié)果表明該菌種以7：3秸稈粉和麥粉，添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養(yǎng)基條件，28一32為適宜培養(yǎng)溫度，30為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h達(dá)到發(fā)酵高峰。2 纖維素酶研究技術(shù)進(jìn)展2.1 產(chǎn)酶菌株選育及誘變育種 利用物理、化學(xué)誘變劑單獨(dú)或復(fù)合處理微生物孢子或細(xì)胞是選育纖維素酶高產(chǎn)菌種的有效方法。如上述中科院微生物研究所董志揚(yáng)等 (2000)用康寧木霉通過(guò)射線和亞硝基胍交替處理，誘變出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株t801；張苓花等 (1998)采用康寧木霉w925、j931，經(jīng)復(fù)合誘變得到產(chǎn)

43、酶活性高菌種等。2.2 dna體外重組技術(shù) 以得到纖維素酶過(guò)量生產(chǎn)為主要目的而進(jìn)行纖維素酶基因克隆研究，在20世紀(jì)80年代十分活躍，在國(guó)外已有約80個(gè)組分的基因被克隆，但表達(dá)、分泌均很弱。由此已逐漸轉(zhuǎn)向應(yīng)用基因工程方法組建有新特性纖維素酶分子。釀造工業(yè)用果膠酶、纖維素酶生產(chǎn)菌的選育研究植物纖維素作為細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分存在于所有的植物中，它是一種均勻葡聚糖，由(1，4)d吡喃葡萄糖基單位的直鏈所組成。果膠物質(zhì)主要由(1，4)d吡喃半乳糖醛酸基單位組成的高聚物，它們存在于細(xì)胞壁的中間層。釀造工業(yè)中的原料都是利用植物的淀粉和蛋白質(zhì)，為了經(jīng)濟(jì)的原因都是將原料粉碎后直接利用，而不是從植物中先提取出淀粉

44、或蛋白質(zhì)再利用，這樣往往會(huì)使淀粉或蛋白質(zhì)利用不完全。采用果膠酶和纖維素酶復(fù)合可以將植物的細(xì)胞壁破碎，從而使得壁內(nèi)物質(zhì)充分釋放出來(lái)，這在果蔬汁飲料加工業(yè)中己得到應(yīng)用。 因此，在釀造工業(yè)中采用果膠酶和纖維素酶等復(fù)合酶制劑將會(huì)縮短發(fā)酵周期，提高原料利用率。 本文從各種曲中篩得黑曲霉563，具有產(chǎn)生果膠酶和纖維素酶的能力，并以此為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變獲得菌株fv4，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，果膠酶活力最高達(dá)到3750u/g，纖維素酶活力達(dá)到1800u/g(本文所有酶活力均以絕干物質(zhì)計(jì))。1 材料與方法1 1材料 麩皮、豆餅、小麥等：無(wú)錫市調(diào)味品廠生產(chǎn)原料。 高溫曲、中溫曲、低溫曲：山東梁山縣濰坊大曲總廠、江蘇

45、雙溝以及安徽文王、劍南春等。 酒藥、玉米粉：超市購(gòu)得。 果膠：浙江衢州果膠有限公司出品。 東酒1號(hào)菌種：上海釀造研究所。 藥品及試劑：購(gòu)于上海化學(xué)試劑公司，均為分析純。 果膠：購(gòu)于sigma公司。1.2 培養(yǎng)基 試管斜面培養(yǎng)基：20%土豆果膠培養(yǎng)基。 液體試管培養(yǎng)基：含5%果膠的麥芽汁(麥汁濃度為2%)；5%果膠和1%花生餅粉。 分離培養(yǎng)基：同試管斜面培養(yǎng)基。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麩皮2g，玉米芯2g，加1%果膠溶液。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將腐敗的香蕉等水果樣或大曲樣加入到液體試管中，于32下培養(yǎng)。挑選最早使液體試管澄清分層的，從中分離菌株于平皿上，再移接于試管斜面培養(yǎng)基上。 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基配好裝于100m

46、l三角瓶中，0.1mpa，121滅菌30min。然后接入一鏟菌皮，于33下培養(yǎng)5d后，測(cè)定酶活力大小。14 分析方法 ph測(cè)定：精密試紙。 果膠酶活測(cè)定：qbl50292。纖維素酶活測(cè)定： q320201jw0071999。 濾紙崩解法：將濾紙條加入15ml緩沖溶液中，50保溫20min，加入05ml酶液，每隔一定時(shí)間觀察濾紙崩解程度，最后統(tǒng)計(jì)濾紙完全消失所需的時(shí)間。2結(jié)果與討論2.1 黑曲霉563菌株的獲得 將各種樣品在液體試管(共50支)中培養(yǎng)，第4天開(kāi)始有變澄清的樣品，第5天只有12支試管出現(xiàn)了分層，培養(yǎng)基變清，其中5支分層明顯，十分澄清。通過(guò)劃線法將5支試管中菌分離于平皿中，培養(yǎng)4d，

47、挑選了40只單菌落，接于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5d，測(cè)定果膠、纖維素酶酶活力，采用直接使用濾紙崩解的方法測(cè)定，選出3株菌進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩時(shí)每株菌做3個(gè)平行樣，取其平均值，3株菌經(jīng)鑒別皆為黑曲霉，分別測(cè)定果膠酶和纖維素酶活力(纖維素酶活力通過(guò)dns法測(cè)定)，結(jié)果如表1所示。從以上結(jié)果可以看出，黑曲霉563產(chǎn)果膠酶和纖維素酶活力均為最高，故確定此菌株為進(jìn)一步研究之出發(fā)菌株。2.2 fv5634菌的獲得 將黑曲霉563分離純化后制成孢子懸液，并涂布于無(wú)菌平皿中，在紫外燈下距離為30cm處分別照射0min、5 min、10min、15min、20min，再用2ml生理鹽水洗下孢子，稀釋涂布于分離平皿上，

48、經(jīng)培養(yǎng)挑選水解圈大的單菌落移接到試管斜面培養(yǎng)，成熟后再接入篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，5d后測(cè)定酶活力。 篩選出高產(chǎn)菌株fv5634，黑曲霉563經(jīng)紫外線照射后的致死率如表2，突變株的形態(tài)變化如表3，復(fù)篩結(jié)果如表4，誘變圖譜如圖1。2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化2.2.1 不同加液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基含水量對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶很重要，培養(yǎng)基加水量少，培養(yǎng)基過(guò)于干燥，菌體接入后不易生長(zhǎng)繁殖，影響發(fā)酵產(chǎn)酶；含水量過(guò)高，麩皮易成團(tuán)，通氣性差，不利于產(chǎn)酶。純麩皮不同加液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖2。純玉米芯(外加0.5g大豆分離蛋白)不同加液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖3。 由于玉米芯多孔疏松吸水量大，在較長(zhǎng)

49、時(shí)間內(nèi)能維持培養(yǎng)基一定的水活度。保證了菌種生長(zhǎng)發(fā)酵所需要的水活度，但水活度過(guò)大影響微生物的生長(zhǎng)和發(fā)酵。2.2.2 不同培養(yǎng)基配比麩皮：玉米芯對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響由表可知，當(dāng)配比為5：5時(shí)，果膠酶酶活相對(duì)最高纖維素酶酶活不是最高，但是與最大值相差不大。2.2.3不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響(見(jiàn)圖4)由圖4可知，添加粳米粉效果最好，其次是蔗糖和玉米淀粉。葡萄糖效果最差，葡萄糖對(duì)酶有代謝阻遏的影響，所以產(chǎn)酶活力低。而粳米粉效果比蔗糖和玉米淀粉好可能粳米粉中含有一定的蛋白的作用。2.2.4不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響(見(jiàn)圖5)由圖5可知，幾種氮源對(duì)產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用，其中有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源效果好，尤其以大豆分離蛋白

50、作為外加氮源時(shí)酶活最高。所以，培養(yǎng)基中可以外加大豆分離蛋白作為外加氮源。大豆分離蛋白由于其含氮量比豆餅粉高，所以大豆分離蛋白為最佳氮源。2.2.5 大豆分離蛋白添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響（見(jiàn)圖6） 圖6可知，當(dāng)大豆分離蛋白添加量為1.0g時(shí)酶活最高，但大豆分離蛋白添加量增加后酶活反而下降，分析原因可能是添加過(guò)量氮源后菌體大量繁殖，消耗過(guò)多營(yíng)養(yǎng)，而使合成酶蛋白比例減少，造成產(chǎn)酶下降。2.2.6 金屬離子對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中需要一些微量元素。適當(dāng)?shù)奶砑咏饘僭貙?duì)產(chǎn)酶可能會(huì)有促進(jìn)作用。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ca2+的適量添加對(duì)酶活力有一定的促進(jìn)作用，但由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，隨著ca2+量的增加，對(duì)酶活有抑制

51、作用如圖7所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)k+的適量添加對(duì)果膠酶活力有一定的促進(jìn)作用，但少量的添加對(duì)果膠酶活無(wú)促進(jìn)作用。k+的適量添加對(duì)纖維素酶活有明顯促進(jìn)作用。且k+對(duì)菌體的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用如圖8所示。2.2.7 培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 ph對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)基初始ph在5.56.0時(shí)，果膠酶、纖維素酶酶活較高。但培養(yǎng)基初始ph為6.0時(shí)纖維素酶酶活比培養(yǎng)基初始ph為5.5時(shí)的酶活高，如圖9所示。發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖10所示。2.2.8 果膠酶和纖維素酶的ph穩(wěn)定性(見(jiàn)圖11)由圖ll可知，當(dāng)ph 3.05.0時(shí)，果膠酶酶活維持在較高值，且果膠酶較穩(wěn)定。當(dāng)ph 4.0-5.0時(shí)，纖維素酶酶活

52、維持在較高值，ph為5.0時(shí)纖維素酶酶活最高。 綜上所述，fv5634菌株在麩皮：玉米芯5：5的培養(yǎng)基中加入20%的大豆分離蛋白，經(jīng)培養(yǎng)后，果膠酶活力達(dá)到3750u/g，纖維素酶活力達(dá)到1800u/g，說(shuō)明fv5634能同時(shí)產(chǎn)生2種酶，并且酶的ph特性符合果蔬加工用酶的要求。纖維素酶耐高溫高產(chǎn)菌株的選育纖維素酶(cellulase)指的是降解纖維素的一類酶的總稱，其中3種主要組分是：內(nèi)切葡聚糖酶(也稱cx酶或cmc酶)；外切葡聚糖酶(也稱c1酶或?yàn)V紙酶)：葡萄糖苷酶。微生物所產(chǎn)生的纖維素酶可以有效降解纖維素中非結(jié)晶部分，水解成葡萄糖。近來(lái)發(fā)現(xiàn)纖維素酶在眾多工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。如李大錦、

53、王汝珍報(bào)道海龍江輕工業(yè)研究所試驗(yàn)在醬油成曲中添加纖維素酶制劑，生產(chǎn)試驗(yàn)表明添加1.24l0-4纖維素酶制劑全氮利用率達(dá)到74.4%，在原有基礎(chǔ)上提高8%，同時(shí)增加了醬油還原糖和色度，改善了醬油的風(fēng)味。目前纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)中由于菌種不抗高溫，在許多地方夏季不能生產(chǎn)，而且纖維素酶活性低，使生產(chǎn)成本高，而導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。因此通過(guò)理化誘變選育耐高溫高酶活菌株仍然是一項(xiàng)重要任務(wù)。 本研究以綠色木霉n。為出發(fā)株，經(jīng)理化復(fù)合誘變，在含有制菌霉素和剛果紅、cmc為惟一碳源的雙層平板中，挑選hc值比n。大的單菌落在不同溫度固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其cmc和fpa酶活，篩選到十幾株耐高溫高酶活菌株，其中110的c

54、mc酶活為29.6u和fpa酶活為129.6u，分別提高2.8倍和2倍。1 材料與方法1 1 菌株 綠色木霉(trichoderma viride)no：本實(shí)驗(yàn)室保藏。1 2 試劑 制霉菌素(nystatin，5060/mg)：sigma公司。 去氧膽酸鈉：上海伯奧生物科技公司。 亞硝基胍：sigma公司。 其它為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭渲品椒▍㈤單墨I(xiàn)1.3 培養(yǎng)基 斜面活化保藏培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基(pda)。 雙層培養(yǎng)基：下層為mandels營(yíng)養(yǎng)液中加2%瓊脂，上層為0.1%去氧膽酸鈉，0.01%剛果紅，1%cmc，1.0%瓊脂溶于mandels營(yíng)養(yǎng)液中。待下層培養(yǎng)基凝固后，將75%乙醇溶解的制霉菌

55、素加入已滅菌冷卻至50左右的上層培養(yǎng)基倒入平皿(每皿約10ml)，使成均勻薄層的制霉菌素濃度梯度平板。 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草：麩皮6：4，加mandels營(yíng)養(yǎng)液溶解，固液比為1：2。1.4 試驗(yàn)萬(wàn)法1.4.1 綠色木霉n。制霉菌素抗性試驗(yàn) 將活化2次的菌種斜面制成孢子懸液，取0.1ml涂布于含制霉菌素濃度為820(8、10、12、14、16、18、20)的梯度平板上，30培養(yǎng)3d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。1.4.2 出發(fā)菌株n。的理化誘變 孢子懸液的制備：用無(wú)菌水洗下經(jīng)活化的斜面孢子，于玻珠小三角瓶中振蕩20min后用4層鏡頭紙過(guò)濾，適當(dāng)稀釋，使孢子濃度為105個(gè)/ml-l06個(gè)/ml。 uv誘變：

56、按參考文獻(xiàn)8。 ntg(亞硝基胍)誘變：按參考文獻(xiàn)9。 上述平板在30培養(yǎng)2d-4d，計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算各因素對(duì)no孢子的致死率，公式如下：以80%90%的致死率為誘變劑量，誘變后，在有制霉菌素的平板上挑取hc值比no大的菌株進(jìn)行固體發(fā)酵復(fù)篩。1.4.3固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩 固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩：250ml三角瓶中裝量3%，其中稻草1.5g，麩皮1g，mandels溶液5ml，高壓滅菌，2%接種，分別在33、35、38、40發(fā)酵72h后測(cè)酶活。1.4.4 測(cè)試方法 粗酶液的制備：將發(fā)酵72h的固態(tài)發(fā)酵纖維素酶5g加200ml水溶解，紗布過(guò)濾后3000r/min離心，再逐步稀釋100倍為待測(cè)酶液。cmc酶活的測(cè)定，

57、酶活力單位定義：在ph5.0，40下，每1g纖維素酶干曲在1min內(nèi)水解cmc生成1mg葡萄糖的酶量，稱為一個(gè)纖維素酶(cmc酶)活力單位(以u(píng)表示)。 濾紙酶活的測(cè)定，酶活力單位定義：在ph5.0，40下，每1g纖維素酶干曲在1h內(nèi)水解新華濾紙，生成1mg葡萄糖的酶量，稱為一個(gè)纖維素酶濾紙酶活單位(以u(píng)表示)。2 結(jié)果與分析2.1 綠色木霉no制霉菌素抗性試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在選擇平板上制菌霉素濃度20u/ml可以抑制沒(méi)發(fā)生變異的孢子生長(zhǎng)，故初篩平板采用20u/ml的制霉菌素濃度。2.2 出發(fā)菌株n。的理化誘變2.2.1 紫外線(uv)誘變致死率 如圖2所示，選擇致死率在80%左右的誘變時(shí)間作為誘變時(shí)間