高中生物《血紅蛋白的提取和分離》學(xué)案3 新人教版選修2

1、血紅蛋白的提取和分離思考1：分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2：蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。思考3： 高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思考4：人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白一、基礎(chǔ)知

2、識(shí)： 凝膠色譜法（分配色譜法）：1、概念：根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的（ ），利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來分離蛋白質(zhì)的有效方法。2、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)（ ）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），而（ ）的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（ ）移動(dòng)，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。3、具體過程：凝膠顆粒相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板A. 的蛋白質(zhì)由于 作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留； 的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在了里之間迅速通過。B.（1） 混合物上柱；（2）

3、洗脫開始， 的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)； 的蛋白質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外；（3） 的蛋白質(zhì)被滯留； 的蛋白質(zhì)被向下移動(dòng)。（4） 不同的蛋白質(zhì)分子完全分開；（5） 的蛋白質(zhì)行程較短，已從 中洗脫出來， 的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。 緩沖溶液：1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。2、作用：能夠抵制（ ）的對(duì)溶液的（ ）的影響，維持PH基本不變。3、緩沖溶液的配制通常由（ ）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ）就可以制得（ ）使用的緩沖液。思考：說出人體血液中緩沖對(duì)？ 思考：在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用

4、的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）電泳：1、概念：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。2、原理：許多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，這些基團(tuán)會(huì)帶上（ ） 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其（ ） 移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（ ），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。陰極陽極加入待分離的樣品帶電性質(zhì)、分子大小和形狀的不同，使分子遷移速度不同分子向陽極移動(dòng)緩沖液瓊脂膠溶液槽凝膠電泳原

5、理示意圖3、分類：瓊脂糖凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳。 測(cè)定（ 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量 ）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入( )。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是( )。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于( )。二 實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理粗分離

6、純化純度鑒定1.樣品處理 (1)紅細(xì)胞的洗滌目的：去除（ ）方法：（ ）離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的（ ），將下層（ ）的紅細(xì)胞液體倒入（ ）再加入用（ ）的（ ）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌低速離心（低速短時(shí)間）重復(fù)4、5步驟（ ）次，直至上清液中已沒有（ ），表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。(2)血紅蛋白的釋放加（ ）到（ ）體積，再加40體積的（ ）（ 溶解細(xì)胞膜） ，置于（ ）上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）, 細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白.(3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到

7、離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min ，試管中的溶液分為4層:第1層（最上層）：（ ）甲苯層第2層（中上層）：（ ）的沉淀層，（ ）色薄層固體第3層（中下層）：（ ）的水溶液層，（ ）的液體第4層（最下層）：其它雜質(zhì)（ ）的沉淀層(4)透析2.凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的（ ），在0.5ml的（ ）頭部切下（ ）長(zhǎng)的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。c.剪尼龍網(wǎng)

8、小圓片覆蓋在（ ）上，用（ ）的尼龍紗將橡皮塞（ ）包好，插到玻璃管一端。d、色譜柱下端用移液頭部做（ ），連接一細(xì)的（ ），并用螺旋夾控制尼龍管的（ ），另一端放入收集（ ）的收集器內(nèi)頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。2）凝膠色譜柱填料的處理（1）凝膠的選擇：（ ）。（2）方法： 配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于（ ）中充分溶脹后，配成（ ）。（3）凝膠色譜柱的裝填方法 固定：將色譜柱處置固定在支架上裝填：將（ ）一次性的緩慢倒入（ ）內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。洗滌平衡 裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，

9、在( )高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分（ ）12小時(shí)。3）樣品加入與洗脫（1）加樣前：打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（ ）緩慢下降到與（ ）平齊，關(guān)閉出口（2）加透析樣品調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用（ ）將1ml（ ）的樣品加到色譜柱的（ ）樣品滲入凝膠床：（ ）洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫收集：待（ ）接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每（ ）收集一試管連續(xù)收集思考：與其它真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液

10、。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。思考：你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（ ）；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的（ ）；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行（ ）。3.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷（ ）的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度電泳方法步驟1)根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板 2）SDS聚丙烯酰胺凝膠制備

11、3）樣品處理： 4）把凝膠固定于電泳裝置上5)加樣：按順序加樣，加樣量通常為1025 L。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前)的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品6)電泳 7）剝膠 8）染色 9)脫色 10)觀察結(jié)果 SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)觀察血液樣品離心后是否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色