第七章體液蛋白質(zhì)檢驗

1、1,第七章 體液蛋白質(zhì)檢驗,人類白蛋白分子,2,本章內(nèi)容概要：,第二節(jié) 體液蛋白質(zhì)測定,第一節(jié) 概述,3,1、掌握血漿蛋白質(zhì)的組成、功能及分類；個別血漿蛋白質(zhì)（前白蛋白、白蛋白）的來源和生理功能；血清總蛋白和白蛋白的測定方法和原理。,2、熟悉急性時相反應(yīng)蛋白的概念和種類；血清球蛋白和纖維蛋白原的測定方法。,3、了解其他蛋白質(zhì)的來源和生理功能；尿液蛋白和腦脊液蛋白的檢測 。,本章教學(xué)要求：,第一節(jié) 概述,4,一、血漿蛋白質(zhì)的分類和功能,組成：,種類：1000種 500種 200種 含量：g mg g 來源：肝臟是蛋白質(zhì)主要的加工廠,（一）血漿蛋白質(zhì)的組成、功能及分類,6,營養(yǎng)作用，修補組織蛋白;

2、 維持血漿膠體滲透壓：主要是白蛋白； 作為PH緩沖系統(tǒng)的一部分：酸性或堿性蛋白質(zhì)； 運輸作用：作為激素、維生素、脂類、代謝產(chǎn)物、離子、藥物等的載體； 體液免疫防御系統(tǒng)：作為免疫球蛋白與補體等免疫分子； 催化作用：酶的本質(zhì)； 代謝調(diào)控作用；作為底物，酶或中間產(chǎn)物抑制或激活組織蛋白酶； 參與凝血與纖維蛋白溶解；：除因子外均可。,血漿蛋白質(zhì)的功能,血漿蛋白質(zhì)的分類,7,7,分離方法,鹽析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半飽和的硫酸銨溶液）,電泳法：,醋酸纖維素薄膜電泳：6種,瓊脂糖凝膠電泳：13種,聚丙烯酰胺凝膠電泳：30種,SDS聚丙烯酰胺凝膠等電雙向電泳：300種,分辨率增高,-,-,-,+,纖維

3、蛋白原,醋酸纖維素薄膜,醋纖膜電泳或瓊脂糖電泳：5個成分 清蛋白 1球蛋白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白 分辨率高時：可有7個成分 有1和2 2中也可有兩條 聚丙烯酰胺凝膠電泳： 可以分出30多種蛋白質(zhì),醋纖膜電泳或瓊脂糖電泳：5個成分,清蛋白 1球蛋白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白,2.電泳分類法,是臨床實驗室常 用的血漿蛋白質(zhì) 電泳方法,分辨率高時：可有7個成分 有1和2 2中也可有兩條 聚丙烯酰胺凝膠電泳： 可以分出30多種蛋白質(zhì),9,3.功能分類法,（1）運輸載體類 血漿脂蛋白：包括CM、VLDL、LDL、HDL等 前清蛋白與清蛋白 甲狀腺素結(jié)合球蛋白 皮質(zhì)素結(jié)合球蛋白 類固醇激素結(jié)合球蛋白

4、視黃醛結(jié)合蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白 觸珠蛋白 血色素結(jié)合蛋白 銅藍蛋白,（2）蛋白酶抑制物：包括1-抗胰蛋白酶、1-抗糜蛋 白酶、2-巨球蛋白等6種以上 （3）血清酶類：血漿固有酶如LCAT等 組織細胞少量釋放的細胞內(nèi)酶 細胞破裂而進入血循環(huán)的細胞內(nèi)酶 （4）蛋白類激素：胰島素、胰高血糖素、生長激素等 （5）凝血蛋白類 （6）免疫球蛋白類 （7）補體蛋白類,（2）蛋白酶抑制物：包括1-抗胰蛋白酶、1-抗糜蛋 白酶、2-巨球蛋白等6種以上 （3）血清酶類：血漿固有酶如LCAT等 組織細胞少量釋放的細胞內(nèi)酶 細胞破裂而進入血循環(huán)的細胞內(nèi)酶 （4）蛋白類激素：胰島素、胰高血糖素、生長激素等 （5）凝血蛋白類

5、（6）免疫球蛋白類 （7）補體蛋白類,還有許多種類的蛋白質(zhì)未被認識,還有許多種類的蛋白質(zhì)未被認識,2.功能分類法,1. 作為運載蛋白 2. 組織蛋白酶抑制物 3. 在血漿中起催化作用的酶 4. 參與代謝調(diào)控作用的蛋白質(zhì)和肽類激素 5. 參與凝血與纖維蛋白溶解 6. 組成體液免疫防御系統(tǒng)（Ig與補體） 所有血漿蛋白質(zhì)能 維持血漿膠體滲透壓 組成血液pH緩沖系統(tǒng),（二）血漿蛋白質(zhì)的功能,生物 化學(xué),急性時相反應(yīng)（acute phase reaction，APR）： 血漿蛋白質(zhì)對急性炎癥和組織損傷的非特異性反應(yīng)。 此時許多蛋白質(zhì)：如1-抗胰蛋白酶、1-酸性糖蛋白、結(jié)合珠蛋白、銅藍蛋白、 C4、C3、

6、纖維蛋白原和C-反應(yīng)蛋白等濃度顯著升高或升高， 而少數(shù)蛋白質(zhì)如前清蛋白、清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白則出現(xiàn)相應(yīng)下降。 急性時相反應(yīng)蛋白(acute phase reactive protein，APP)：對急性炎癥和組織損傷起非特異反應(yīng)從而出現(xiàn)濃度變化的血漿蛋白質(zhì)。 增加的蛋白質(zhì)稱為正向APP 下降的蛋白質(zhì)稱為負向APP,12,1.急性時相反應(yīng),（三）影響血漿蛋白質(zhì)濃度的因素,機體哪些情況會出現(xiàn)急性時相反應(yīng)？ 急性細菌性感染如急性肺炎、鏈球菌感染性腎炎 急性非特異性炎癥如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性心臟病等 急性心肌梗死 惡性腫瘤 手術(shù)、創(chuàng)傷,13,APR的機制,炎癥損傷部位釋放的細胞因子，包括白

7、介素、腫瘤壞死因子和、干擾素以及血小板活化因子等， 引發(fā)肝細胞中上述蛋白質(zhì)合成量的改變。 正向APP是機體防御機制的一個部分，如： 增加的蛋白酶抑制劑控制組織中的酶活性 觸珠蛋白保護從破壞紅細胞中釋放的Hb C反應(yīng)蛋白等可活化補體 負向APP多作為營養(yǎng)蛋白，此時合成減少，可為合成正向APPs提供更多的氨基酸原料。,14,APR的時相,C-反應(yīng)蛋白：首先升高 1-酸性糖蛋白：12小時內(nèi)也升高 1-抗胰蛋白酶、觸珠蛋白、C4和纖維蛋白原然后升高 C3和銅藍蛋白：最后是升高 通常在25天內(nèi)這些APPs達到最高值,15,測定APP的臨床意義,幫助監(jiān)測炎癥的發(fā)生、變化和觀察治療反應(yīng)， 尤其是那些升高最早

8、和最多的蛋白質(zhì),16,30,二、血清蛋白質(zhì)電泳組分的臨床分析,血漿蛋白質(zhì)和血清蛋白質(zhì)有何不同？ 血漿：為生理狀況 血清：為常用檢測標本,血漿蛋白質(zhì)和血清蛋白質(zhì)有何不同？ 血漿：為生理狀況 血清：為常用檢測標本,31,（一）血清蛋白質(zhì)電泳的正常組分及其含量,清蛋白：5768 1球蛋白：1.05.7 2球蛋白：4.911.2 球蛋白：713 球蛋白：9.818.2,醋纖膜電泳正常百分含量 清蛋白：5768 1球蛋白：1.05.7 2球蛋白：4.911.2 球蛋白：713 球蛋白：9.818.2,醋纖膜或瓊脂糖電泳正常區(qū)帶,區(qū)帶圖譜,掃描圖譜,kk,1.腎病綜合征,2. 肝硬化,正常圖譜,典型的-橋

9、,不典型-橋,IgG型,IgA型,3.多發(fā)性骨髓瘤,2,典型的異常電泳圖譜及其掃描曲線,（四）球蛋白增多與M蛋白,Ig多克隆性增多：區(qū)帶呈彌散性升高 見于反復(fù)或慢性感染、自身免疫性疾病、肝細胞 疾病或寄生蟲感染。 Ig單克隆性增多M蛋白：區(qū)帶局部有深染窄帶 漿細胞病、尤其惡性漿細胞病時， 異常漿細胞單克隆增殖， 產(chǎn)生大量單克隆Ig或輕鏈或重鏈片段， 病人血清或尿液中可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)單一的M蛋白,Ig多克隆性增多：區(qū)帶呈彌散性升高 見于反復(fù)或慢性感染、自身免疫性疾病、肝細胞 疾病或寄生蟲感染。 Ig單克隆性增多M蛋白：區(qū)帶局部有深染窄帶 漿細胞病、尤其惡性漿細胞病時， 異常漿細胞單克隆增殖， 產(chǎn)生大量

10、單克隆Ig或輕鏈或重鏈片段， 病人血清或尿液中可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)單一的M蛋白,22,23,二、血漿蛋白質(zhì),（一）前白蛋白（PA） （二）白蛋白（ALB） （三）1-酸性糖蛋白（AAG） （四）甲胎蛋白(AFP) （五）結(jié)合珠蛋白(Hp) （六）2-巨球蛋白(AMG) （七）銅藍蛋白(CER/CP) （八）轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF) （九）2 微球蛋白(BMG) （十）C-反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP),24,結(jié)構(gòu)： MW=54000，四個相同亞基構(gòu)成的四聚體。 理化性質(zhì)：p4.7，肝細胞合成，半壽期12 小時。 測定方法：免疫比濁法免疫擴散技術(shù)。,25,功能：營養(yǎng)指標，載體功能（甲狀腺素維生素）。 臨床意義： 1.作為

11、營養(yǎng)不良的早期指標； 2.作為肝功能不全的指標，比Alb更靈敏； 3.負性急性時相反應(yīng)蛋白，急性炎癥，惡性腫瘤， 肝硬化及腎炎等情況下，PA迅速降低。 參考值： 0.180.45g/L 。,26,急性時相反應(yīng)蛋白,27,28,29,結(jié)構(gòu)：585個aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽， MW=66458，含17個二硫鍵。 理化性質(zhì)：pI=45.8，肝細胞合成但不儲存，半衰期為15-19 天，占總蛋白的40%60%，p7.4時帶負電。 測定方法：色素結(jié)合法:溴甲酚綠（BCG），溴甲酚紫（BCP）,鹽析等。,（二）白蛋白（ALB）急性時相反應(yīng)蛋白,30,功能：營養(yǎng)作用，載體功能（高親和力），維持血漿滲透壓和正常p

12、值。 臨床意義：合成受食物影響，敏感性較低。 降低:在營養(yǎng)不良，肝功不全，急慢性肝疾病時; 增高:少見,假性升高。 參考值：35-50 g/,31,功能：蛋白酶抑制物（具有90的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，彈性蛋白酶，但此抑制作用有明顯的p依賴性。 臨床意義： 降低：血漿AAT僅見于胎兒呼吸迫綜合癥。 升高：炎癥、術(shù)后，某些激素治療后。 參考值： 0.831.99g/L,32,結(jié)構(gòu)：181個aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽， MW=4萬，含45%的糖，其中唾液酸占11%12%。 理化性質(zhì)：pI值2.73.5，肝合成，膿毒癥時粒細胞和單核細胞及某些腫瘤組織也可合成。 位于1-球蛋白區(qū)帶。 測定方法：免疫

13、化學(xué)法（擴散,濁度）,化學(xué)法（間接法），ELISA法等,（三）1-酸性糖蛋白（AAG） 急性時相反應(yīng)蛋白,33,功能：與免疫防御功能有關(guān)，機制不詳；抑制血小板凝集影響膠原纖維形成；參與脂類運輸。 臨床意義： 升高：急性炎癥，組織損傷，風(fēng)濕，腫瘤，AMI ，潰結(jié)時； 降低：營養(yǎng)不良降低, 嚴重肝損傷和雌激素作用。 參考值：.252.0g/L 。,34,結(jié)構(gòu)：590個aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽， MW=6.5萬萬，含4%的糖。 理化性質(zhì)：pI值.7-.8，在白蛋白和1-球蛋白之間。胎兒肝卵黃囊合成，成人量微，升高由于腫瘤細胞合成。 測定方法：免疫化學(xué)法（擴散,火箭電泳）,ELISA等,（四）甲胎蛋白(

14、AFP),35,功能：胎兒血漿主要蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)肝細胞生長和腦細胞發(fā)育；抑制細胞和體液的免疫反應(yīng)；維持正常妊娠，防止母嬰排斥。 臨床意義：胎兒產(chǎn)前監(jiān)測（羊水或母血） 增高：原發(fā)性肝癌患者診斷和鑒別（80%原發(fā)增高）， 其他癌癥也可見增高。 參考值：20-100g/L(成人) 5g/L(新生兒),36,結(jié)構(gòu)： 兩對肽鏈形成四聚體，有變異體。 理化性質(zhì)：肝合成， pI 值為4.1，電泳位a2 -球蛋白區(qū)帶 測定方法：電泳法，免疫化學(xué)法（擴散,濁度）,化學(xué)法等,（五）結(jié)合珠蛋白(Hp) 急性時相反應(yīng)蛋白,37,功能： 與紅細胞中釋出自由Hb 結(jié)合,防止Hb 從尿中丟失保存鐵, 急性溶血后一周再生恢復(fù)。

15、 高效的過氧化物酶。 需鐵細菌的天然抑菌劑。 臨床意義： 升高：急性時相反應(yīng)； 降低：血管內(nèi)溶血時；雌激素作用。 參考值：0.5-2.2 g/L,38,結(jié)構(gòu)： MW=6280 萬,分子量最大，由四個相同的亞基組成，含糖量約。 理化性質(zhì)：肝細胞與單核吞噬細胞系統(tǒng)中合成，半壽期5 天。 測定方法：免疫化學(xué)等,（六）2-巨球蛋白(AMG),不屬于急性時相反應(yīng)蛋白,39,功能：與多種分子和離子結(jié)合，影響蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制劑具有選擇性保護某些酶的作用）。 臨床意義：嬰幼兒及兒童比成人高； 升高：雌激素，低蛋白血癥尤其是腎病綜合征時，可顯著升高以維持血漿膠體滲透壓； 降低：胰腺炎及前列腺癌時

16、。 參考值：1.31-2.93g/L,40,結(jié)構(gòu)： MW=12-16 萬, 1046個aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽，含糖約，每分子銅藍蛋白可結(jié)合個銅原子。 理化性質(zhì)：肝合成,巨噬細胞和淋巴細胞合成少量；pI 值為4.4， 具遺傳基因多態(tài)性。 測定方法：免疫化學(xué)（擴散或比濁）等,（七）銅藍蛋白(CER/CP) 急性時相反應(yīng)蛋白,41,功能：具氧化酶活性且起抗氧化劑作用，銅的無毒代謝庫 臨床意義： 增加感染,創(chuàng)傷,腫瘤; 降低-營養(yǎng)不良，嚴重肝病及腎綜;協(xié)助診斷Wilson病（肝豆狀核變性） 參考值：0.21-0.53g/L,42,結(jié)構(gòu)： MW=7.7 萬,單鏈糖蛋白，含糖約。 理化性質(zhì)：肝細胞合成，

17、pI 值為5.5-5.9,半壽期7 天，可逆結(jié)合多價離子如Fe、Cu、Zn、Co 等，一分子TRF 可結(jié)合兩個三價鐵。 測定方法：免疫擴散法，放免法和免疫比濁法等。,（八）轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF/Tf) 急性時相反應(yīng)蛋白,43,功能：運輸鐵。 臨床意義：血TRF 濃度受鐵供應(yīng)調(diào)節(jié)，缺鐵TRF升高，鐵治療后恢復(fù)?？捎糜谪氀脑\斷（缺鐵性低色素性貧血TRF升高，再障時TRF正?；蛘呓档停┖蛯χ委煹谋O(jiān)測。 降低:急性時相反應(yīng)、慢性肝病、營養(yǎng)不良及蛋白丟失時； 升高：妊娠或雌激素會使其降低;缺鐵性低色素貧血。 參考值： 2.5-4.3 g/L (成人) 1.30-2.75 g/L (新生兒),44,結(jié)構(gòu)：

18、MW=11800， 100個aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽，分子中含一對二硫鍵，不含糖。 理化性質(zhì)： pI 值為5.7，淋巴細胞合成，存在細胞表面，特別是淋巴和腫瘤細胞。釋放入血循環(huán)。半衰期107 分鐘，幾乎由腎小管回收。 測定方法：放射免疫化學(xué)等。,（九）2 微球蛋白(BMG),45,功能：分子量小，可自由通過腎小球濾過膜，在腎小管幾乎全部重吸收，可監(jiān)測腎小管功能；是HLA（人類白細胞抗原）鏈的輕鏈部分。 臨床意義：增高：腎功能衰竭，炎癥及腫瘤時。 參考值：1.0 2.5 mg/L （血漿）,性質(zhì)：因在急性炎癥病人血清中出現(xiàn)，可結(jié)合肺炎球菌細胞壁C-多糖的蛋白質(zhì)而命名。 結(jié)構(gòu)： MW11.5-14

19、萬，分子含個相同的亞基，亞基間靠非共價鍵連接成圓盤狀多聚體。 理化性質(zhì)：肝合成， pI 值為6.2，電泳位于 區(qū)帶。 測定方法：半定量沉淀法（早），免疫化學(xué)法。,（十）C-反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP) 急性時相反應(yīng)蛋白,47,功能：結(jié)合多糖，磷脂和核酸；激活補體，抗凝。 臨床意義： 第一個認定的急性時相反應(yīng)蛋白,是急性時相反應(yīng)的一個敏感指標，在、創(chuàng)傷、感染、外科手術(shù)、腫瘤浸潤時含量迅速升高，達到正常的2000倍。 CRP是非特異性指標，需結(jié)合臨床病史。 參考值： 8.0mg/L （血漿）,48,急性時相反應(yīng)蛋白分類：,升高：其他種蛋白質(zhì)。,降低：前白蛋白、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白,49,第二節(jié) 體液蛋白質(zhì)測定

20、,總蛋白測定,個別蛋白質(zhì)的測定,蛋白分離測定技術(shù),發(fā)展趨勢:,測定體液標本:,血漿：普遍,尿液，腦脊液和胸腹水等：有選擇性的組織病變檢查,50,免疫化學(xué)法特異定量個別蛋白質(zhì),體液蛋白質(zhì)的測定方法概括：,常規(guī)：免疫濁度法、免疫擴散法，免疫電泳法， 微量：放射免疫測定（RIA），酶免疫測定法（ELA/ELISA）,51,電泳測定：,定量化學(xué)測定TPr，Alb,電泳 組成圖譜 半定量 定量,染料結(jié)合法，UV法，折光法等,52,一、血清總蛋白測定,假設(shè)：,、 純多肽鏈，含氮量平均為16 % 、各種蛋白質(zhì)與化學(xué)試劑反應(yīng)性一致，僅為相對定量,53,測定依據(jù)：蛋白質(zhì)測定一般利用蛋白質(zhì)以下的結(jié)構(gòu)或性質(zhì),1、元

21、素組成測定：含N穩(wěn)定； 2、重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)：具有多個肽鍵； 3、酪氨酸和色氨酸與Folin-酚試劑反應(yīng)顯色或UV 吸收； 4、與色素結(jié)合的能力：與染料以離子鍵或共價鍵連接； 5、沉淀后借濁度測定：光度計測定； 6、光折射測定：折射儀測定。,54,方法：,1.凱氏定氮法參考方法2.雙縮脲法( 推薦) 3.酚試劑法4.散射比濁法 5.染料結(jié)合法6. UV 法 .折光測定法,55,1.凱氏定氮法參考標準方法(0.05mg N 0.3g pro),消化用濃硫酸將蛋白質(zhì)消化為硫酸銨；（耗時） 蒸餾用堿性溶液堿化消化液并蒸餾揮發(fā)； 吸收用酸性溶液（硼酸）吸收氣態(tài)氨（使H+ ） 滴定用已標定的無機酸滴（使H

22、+ 恢復(fù)），計算總氮量 定蛋白（總氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,納氏試劑：碘化汞和碘化鉀的堿性溶液與氨反應(yīng)生成淡黃棕色膠態(tài)化合物，其色度與氨氮含 量成正比。,原理：,56,評價：,優(yōu)點：準確度高，精密度高，靈敏度高，是公認的參考方法。 缺點：操作復(fù)雜，費時，不適合常規(guī)檢測，血清各蛋白含氮量會有所變化尤其是疾病時。,應(yīng)用：標準蛋白的標定及校正其它常規(guī)方法,57,2.雙縮脲法,原理：,蛋白質(zhì)中的肽鍵（-CONH-）在堿性溶液中能與Cu2+作用而產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)。,條件：至少含兩個肽鍵（-CONH-）基團才能和Cu2+形成

23、絡(luò)合物,氨基酸及二肽無反 應(yīng),三肽以上才能反應(yīng)。,雙縮脲生成,58,評價：,優(yōu)點：簡便，準確，重復(fù)性好，10g-120g/L線性好，特異性與精密度好，批內(nèi)CV%2%，顯色穩(wěn)定。 缺點：靈敏度較差，對蛋白質(zhì)含量低的體液標本不適合。,應(yīng)用：常規(guī)推薦方法。手工或上機使用。,59,3.酚試劑法,原理：,蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基和色氨酸殘基能夠和酚試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸反應(yīng)生成藍色化合物，,Lowry改良法：在酚試劑中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的靈敏度，為雙縮脲法的100倍左右。,60,評價及應(yīng)用：,優(yōu)點：操作簡單，改良法靈敏度高（10g-60g），適合測定蛋白含量少的標本。 缺點：各種蛋白

24、質(zhì)酪氨酸和色氨酸比例不同，只適合測定單一蛋白質(zhì)。受一些藥物干擾。,61,4.比濁法,原理：,評價及應(yīng)用：,優(yōu)點：簡便不需特殊儀器。 缺點：濁度形成的干擾因素多（加試劑方法，反應(yīng)溫度，蛋白絮狀沉淀等）,某些酸類（磺基水楊酸等）和血清蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀，測其濁度，與標準對比，可求蛋白含量。,62,5.染料結(jié)合法,在酸性環(huán)境下，帶正電的蛋白質(zhì)（-NH3+)與染料的陰離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)，使染料的吸收峰改變，可既而用分光光度法比色測定。,原理：,常用染料：氨基黑，考馬斯亮藍等,評價及應(yīng)用：,優(yōu)點：操作簡便，重復(fù)性好，靈敏度高，且干擾因素少。 缺點：特異性不高；不同蛋白質(zhì)和染料的結(jié)合力不一致，標準物不易確定

25、。,63,6.紫外分光光度法,蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白質(zhì)溶液在280nm處有一吸收峰。可用于測定蛋白質(zhì)但需避免核酸干擾。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260,原理：,64,評價及應(yīng)用：,優(yōu)點：敏感而簡便，可保留蛋白生物活性，常用與較純的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度計及石英比色皿。 缺點：各種蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm測定易受游離色aa和酪aa以及尿

26、酸和膽紅素的干擾；導(dǎo)致準確性和特異性受影響。 措施：在220-225nm波長區(qū)域，用0.15mol/l的NaCl稀釋1000-2000倍可消除干擾。,65,7.折光測定法,溶解在溶液中的固體可增加溶液的光折射率，在固定波長和溫度下，光折射率和血清中蛋白質(zhì)含量成正比。,原理：,評價及應(yīng)用：,優(yōu)點：簡便、快速，易掌握，重復(fù)性較好，適合臨床急診，體檢篩查和胸腹水蛋白質(zhì)測定。 缺點：準確性較差，易受高血脂癥，高膽紅素血癥以及溶血等因素影響，會由于A/G比值變化而產(chǎn)生誤差。,66,參考范圍：成人6080g/L,臨床意義：,總蛋白升高：,總蛋白降低：丟失過多 消耗增加 白蛋白合成減少 水腫,真性升高：MM

27、、巨球蛋白血癥、自身免疫性疾病等,假性升高：機體明顯失水，總蛋白含量相對升高， A/G幾乎不變,67,二、血清白蛋白測定,方法：,1.染料結(jié)合法( 推薦) 2.鹽析法 3.電泳法4.免疫化學(xué)法,68,1.染料結(jié)合法( 推薦),原理: 血清ALB可通過離子鍵或疏水鍵與包括染料在內(nèi)的各種有機離子結(jié)合,而GLB很少結(jié)合外源性染料,可在不分離ALB與GLB的情況下直接測定ALB。,染料,BCG,BCP,優(yōu)點,缺點,易于和非人源性白蛋白結(jié)合 與白蛋白結(jié)合特異性較差,與非人源性白蛋白結(jié)合力弱 與白蛋白結(jié)合特異性好,在30秒內(nèi)測可提高特異性,69,應(yīng)用及評價:,嚴格控制反應(yīng)時間的BCG法既適合手工也適合自動

28、 化分析。臨床上推薦使用。,70,原理: 鹽析是由于加入大量的中性鹽破壞了蛋白質(zhì)的水化膜、中和其所帶的電荷從而使蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀析出。 各種蛋白質(zhì)的親水性和帶電荷不同，故鹽析時所需鹽濃度與pH不同。GLB在生理pH下帶電荷及水化膜比ALB少，可被較低濃度中性鹽沉淀。,2.鹽析法,中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉等,71,應(yīng)用及評價:,操作繁瑣， 不宜自動化，基本不用,72,3.電泳法,操作：,醋纖膜電泳,染色,晾干,透明,光密度儀掃描,洗脫,比色,染色,分離,測得蛋白組分百分比,計算得出各種蛋白質(zhì)含量,半定量,定量,73,評價及應(yīng)用：,優(yōu)點：電泳特異性好，可了解血清蛋白質(zhì)全貌,缺點：電泳技術(shù)繁瑣，不

29、易自動化；白蛋白與染料 親和力高會導(dǎo)致結(jié)果偏高,74,4.免疫化學(xué)法,原理及特點:,應(yīng)用：特異性高,但成本較高,費時,生化檢驗用的不多.,75,參考范圍:成人3555g/L.,臨床意義：,白蛋白升高：,白蛋白降低：丟失過多 消耗增加 白蛋白合成減少 水腫 先天性ALB缺乏病,真性升高：未見,假性升高：機體明顯失水，或治療輸入過多白蛋白,76,三、血清球蛋白測定,方法：,間接法:TP-ALB=GLB,直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸遠大于ALB中的色氨酸含量),色氨酸+乙醛酸 紫色化合物,H+,Hopkins-Cole反應(yīng):,參考范圍: 成人2030g/L. A/G：1.52.5 A/G1,比例倒置，清蛋白降低亦可因球蛋白增高引起，見于嚴重肝功能損傷及M蛋白血癥，如慢性重度以上持續(xù)性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥等。,77,臨床意義：,球蛋白升高：,球蛋白降低：合成減少、低或無-球蛋白血癥,真性升高（常見）：自身免疫性疾病、感染反 應(yīng)、MM、巨球蛋白血癥。,假性升高（少見）：機體明顯失水。,78,四、血漿纖維蛋白原測定,血漿纖維蛋白原：,結(jié)構(gòu)特點：凝血因子，肝合成，MW=3