分子生物學檢測室技術(shù)要求與質(zhì)量控制.ppt

1、分子生物學檢測實驗室技術(shù)要求與質(zhì)量控制,國家質(zhì)檢總局動植物檢疫實驗所 二OO四年六月,實驗室技術(shù)要求,總體要求 質(zhì)量控制 質(zhì)量保證,實驗室總體要求,實驗室分區(qū)要求 實驗室工作人員要求 安全防護 廢棄物處理 結(jié)果判斷與驗證,實驗室分區(qū)要求設施和環(huán)境要求,各工作區(qū)域設置緩沖間，緩沖間的壓力為負壓（或上設抽風裝置），與其相連的工作間為正壓，工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。 不同功能的核酸檢驗工作區(qū)應是分隔獨立的工作室，并有明顯的標志，各區(qū)間不能直通。各區(qū)之間如果是緊密相連，需安裝物品傳遞艙。 每個工作區(qū)域的頂部應安裝紫外燈，紫外燈的波長為254 nm，安裝數(shù)量為每20 m2安裝一支40W的紫外

2、燈，燈與地面的距離不宜超過（2.00.1）m。,實驗室分區(qū)要求 工作區(qū)域的設置及要求,核酸檢驗區(qū) 試劑貯存和準備區(qū); 樣品制備區(qū); 核酸制備區(qū) 擴增區(qū); 擴增產(chǎn)物分析區(qū) 蛋白質(zhì)檢驗區(qū) 蛋白質(zhì)分離純化區(qū) 蛋白質(zhì)檢測區(qū) 其它區(qū)域 設置洗滌消毒室（洗滌、消毒、制備純水和/或雙蒸水、制冰等）、高速/超高速離心機室、低溫/超低溫冰箱室等。,主要功能：原裝試劑和配制試劑的貯存，所有試劑的配制與分裝。 工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的試劑貯存和準備區(qū)，工作區(qū)域為正壓。 注意事項：當試劑經(jīng)質(zhì)檢合格后，應將其分裝貯存?zhèn)溆?，貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反應數(shù)決定。用于擴增的試劑應冰凍貯存

3、。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 試劑貯存和準備區(qū),核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 樣品制備區(qū),主要功能：實驗室樣品的混樣和測試樣品的制備。 工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的樣品制備區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，可安裝排風系統(tǒng)。 注意事項：此區(qū)應遠離其它實驗操作區(qū)；粉碎樣品時的器皿應單獨使用，所用的器具在使用前應經(jīng)過徹底清洗并高壓消毒，防止交叉污染；稱取的測試樣品應加蓋后再移至樣品核酸制備區(qū)。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 核酸制備區(qū),主要功能：核酸的提取純化與貯存；核酸含量的測定；測試樣品DNA的保存。 工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的核酸制備區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，可安裝排風系統(tǒng)。 注意事項：已純化的核酸應保存于20或80

4、，避免反復凍融；陽性和陰性標準物質(zhì)DNA可調(diào)整至常用的使用濃度后分裝并冷凍保存。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 擴增區(qū),主要功能：PCR擴增反應體系的配制和模板的加入，核酸擴增。 工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的擴增區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，可安裝排風系統(tǒng)。 注意事項：嚴格限制無關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動；加樣應在超凈工作臺（生物安全柜）內(nèi)進行，超凈工作臺的氣流方向宜選擇垂流式；巢式PCR的第二次加樣必須在此區(qū)進行。,核酸檢驗區(qū)各區(qū)功能 擴增產(chǎn)物分析區(qū),主要功能：擴增產(chǎn)物的測定 工作區(qū)域的壓力要求：未設緩沖間的擴增產(chǎn)物區(qū)，工作區(qū)域為負壓或減壓，應安裝排風系統(tǒng)。 注意事項：此區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源

5、，應遠離其它實驗操作區(qū)；使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，應使用洗板機洗板。 若實驗僅采用全自動擴增檢測儀（如實時熒光定量PCR儀），可將擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū)合并為一個區(qū)。,蛋白質(zhì)檢驗區(qū) 功能及要求,蛋白質(zhì)分離純化區(qū) 主要功能：用于蛋白質(zhì)的分離與純化。 工作區(qū)域要求：蛋白質(zhì)純化應具備低溫工作的場地，如4冷房和/或?qū)游龉竦取?蛋白質(zhì)分離純化區(qū) 主要功能：蛋白質(zhì)分析檢測,檢測工作流程,實驗室樣品到樣驗收（確定是否具備檢驗的基本條件）混樣獲取測試樣品測試樣品的制備（待檢狀態(tài)） 核酸和/或蛋白等目標物質(zhì)的提取 PCR實驗（包括擴增和產(chǎn)物分析）和/或蛋白質(zhì)檢測結(jié)果判定結(jié)果表述（出具檢驗報告）,

6、實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 工作人員操作要求,按照ISO/IEC 17025：1999中5.2的要求。 應具備良好的分子生物學專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。 方向：試劑貯存和準備區(qū)樣本制備區(qū)核酸制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū),各實驗區(qū)域應有專用的儀器設備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設備、物品和工作服應有明顯標記，避免與其他區(qū)域的儀器設備混用。 儀器設備的校準應符合ISO/IEC 17025：1999中5.5的規(guī)定。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 儀器設備要求,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 試劑要求,除另有規(guī)定外，所有實驗使用的試劑等級應為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑。試劑的選購、驗收、貯存應符合ISO/IEC 170

7、25：1999規(guī)定。 實驗用水應符合GB 6682-92中一級水的規(guī)格。去離子水的電阻應達到18.2。 商品試劑盒應注明到貨日期，對所收到的試劑盒應按規(guī)定的貯存條件存放。 對菌種、質(zhì)粒、動植物細胞組織的貯存與保管應符合ASTM E 1342-97的規(guī)定。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 試劑配制,實驗室配制的試劑應在容器上標明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期及配制者姓名。 所用試劑溶液宜大體積配制、小體積分裝后高壓滅菌保存，不宜高壓滅菌的試劑應過濾（0.22 m）除菌；PCR主混液、引物、探針應避免反復凍融。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 試劑配制,實驗室應確定關(guān)鍵試劑，并在使用前進行質(zhì)量檢

8、測。關(guān)鍵試劑包括：核酸提取試劑、RNase、蛋白酶K、陰性對照標準物質(zhì)、陽性對照標準物質(zhì)、Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、引物、探針、菌種、陽性質(zhì)粒。 試劑質(zhì)檢包括有無污染，是否存在假陽性；使用弱陽性對照標準物質(zhì)檢測試劑的擴增效果。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 防止污染, 嚴格實驗室分區(qū) 對實驗室進行功能分區(qū)，各區(qū)的工作服、實驗用具和實驗記錄本應區(qū)分標記，不能混用。 樣品管理 送檢樣品的包裝應完好并有明確的標識；在對實驗室樣品進行混樣、測試樣品的制備和稱量過程中應避免交叉污染。 實驗過程的質(zhì)量控制,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 實驗過程的質(zhì)量控制, 實驗室環(huán)境對照 陰性質(zhì)控對照 核酸提取空白對照：核酸提

9、取過程中不加樣品的空白管； PCR試劑對照：不含DNA/cDNA模板的PCR擴增反應液試劑； 陰性目標DNA對照：即為內(nèi)源基因?qū)φ?，與測試樣品等同處理。 陽性質(zhì)控對照 檢驗PCR反應是否正常進行 PCR抑制物對照 檢測PCR反應體系中是否存在水溶性抑制物質(zhì)。當PCR反應無擴增結(jié)果和定量PCR時宜設此對照。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 避免各類實驗污染, 避免擴增產(chǎn)物污染 PCR擴增反應液中加入UDG酶，以dUTP代替dTTP可防止以前PCR擴增產(chǎn)物所致的遺留污染。 避免RNase污染（RNA檢測） 戴口罩和手套; DEPC; 高溫烘烤; RNase抑制劑 避免操作過程污染 實時熒光PCR和總核酸

10、雜交法可防止操作過程的污染，實時熒光PCR尤其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室重要的防污染措施之一。,陽性樣品,陰性樣品,Ct 值,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和油菜籽的實時熒光PCR檢測,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 室間質(zhì)量評價測試,凡對外開展基因檢測并出具檢測報告的實驗室，應定期參加國家有關(guān)法定部門組織的檢驗項目的室間質(zhì)量評價測試。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 實驗室清潔, 清潔方向 應按檢測工作流程方向進行： 試劑貯存和準備區(qū)樣品粉碎區(qū)核酸制備區(qū)擴增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū) 清潔用具 不同實驗區(qū)域的清潔用具應固定，不能交叉使用。工作結(jié)束后應立即對工作區(qū)域進行清潔。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 實驗室清潔, 實驗室空間 實驗室空間應定

11、期進行紫外照射。 實驗臺面和儀器設備的清潔 實驗臺面、超凈工作臺宜用3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液（含有效氯1 g/L）擦拭清潔；也可在擦拭后再用紫外光照射，照射距離應不超過90 cm，照射時間宜過夜。 注：10%次氯酸鈉和3%雙氧水應在使用前配制，配制好的溶液不宜長期存放。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 有毒有害及廢棄物質(zhì)的處理, 移液器吸頭 使用過的移液器吸頭應放入含有10%次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，浸泡時間不宜少于24 h。 PCR產(chǎn)物 含有PCR產(chǎn)物的所有液體及廢棄物應放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡時間不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法檢測時洗板機洗板所產(chǎn)生的廢液應收集至1 mol/L HCl溶液中。 瓊脂糖凝膠及電泳液 對含有EB或經(jīng)EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理參見分子克隆。 陽性樣品和質(zhì)粒 陽性質(zhì)粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡時間不宜少于6 h。,實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 安全防護,紫外線 應佩戴具有紫外線防護功能的護目鏡和/或防護面罩，并遮蔽暴露的皮膚。紫外照射消毒后由于空氣中臭氧富集，不宜立即開始工作，應在停止紫外照射30 min后開始工作，有條件的實驗室，可安裝無臭氧紫外燈。 溴化乙錠 在接觸溴化乙錠