線蟲的EMS誘變和突變體篩選2015

1、線蟲的EMS誘變和突變體篩選摘要：秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一種被廣泛研究的模式生物，其性狀容易辨別，突變型多且容易獲得。本實(shí)驗(yàn)用EMS誘變劑對(duì)同步化后的N2型懷卵成蟲線蟲進(jìn)行不定向誘變，篩選出一系列的突變體，再通過對(duì)親代突變體的子代進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，篩選出F1、F2、F3突變體，最后獲得性狀穩(wěn)定的、能夠穩(wěn)定遺傳的突變體，可以將突變體至于-80保存。本次試驗(yàn)涉及到的生物技術(shù)有：無菌操作技術(shù)，同步化技術(shù)，EMS誘變技術(shù)，顯微操作技術(shù)等。將獲得的突變體與野生型作對(duì)比，可以在顯微鏡下觀察到性狀明顯的突變體，將突變體轉(zhuǎn)移、傳代、保留，最后獲得穩(wěn)

2、定的突變體。關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲同步化 EMS誘變無菌操作技術(shù)突變體1.引言秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一種以細(xì)菌為食，居住在土壤中，無毒無害、可以獨(dú)立生存的線蟲。它有如下幾個(gè)特點(diǎn)：其個(gè)體小，成體僅1mm長(zhǎng)，雌雄同體全身共有959個(gè)細(xì)胞，雄性線蟲全身共有1031個(gè)體細(xì)胞；為雌雄同體：雄性個(gè)體僅占群體的0.2%，可自體受精或雙性生殖；染色體組簡(jiǎn)單：只有5對(duì)常染色體和1對(duì)性染色體；基因組便于研究：基因組大小僅為100Mb，并且內(nèi)含子少，基因密度高；生活周期短且隨溫度變化：線蟲整個(gè)的生命周期僅3天（25）。野生型線蟲胚胎發(fā)育中細(xì)胞分裂和細(xì)胞系的

3、形成具有高度的程序性，這樣就便于對(duì)其發(fā)育進(jìn)行遺傳學(xué)分析。溫度越高，生活周期越短；有大量突變株；繁殖能力強(qiáng)：成蟲一生可產(chǎn)300個(gè)受精卵；易于保存：可以用-80冰箱長(zhǎng)期保存線蟲作為模式生物，與酵母、果蠅、斑馬魚、小鼠和擬南芥等一起，為生命科學(xué)的發(fā)展做出了極大的貢獻(xiàn)。它與其他模式生物相比，有自身優(yōu)勢(shì)，如：它只有消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，并且肉眼可見，容易研究；它是目前最適合大規(guī)模藥物篩選的多細(xì)胞動(dòng)物，它的研究成本低：既提供了一個(gè)完整動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，又避免了小鼠模型的高價(jià)費(fèi)時(shí)等。但也有其缺點(diǎn)，如：線蟲的神經(jīng)元細(xì)胞對(duì) RNAi不敏感；線蟲沒有心臟、獲得性免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等，所以一些人類疾病無法在線蟲中模擬；鑒

4、于線蟲與人類種間距離太遠(yuǎn)，線蟲的作用仍是在藥物研發(fā)初期，快速粗篩，提供線索，需要再經(jīng)過哺乳動(dòng)物模型的“細(xì)篩”?；诰€蟲的自身體積小并且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外眾多的科研機(jī)構(gòu)都在以線蟲作為研究材料，在RNAi、衰老、藥物篩選、功能基因組學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，線蟲中大約有35%的基因是在人體中具有等同作用，并且有大量人類遺傳疾病同源基因，只有大約58%是線蟲特有的，所以，從理論上講, 只要人類疾病的靶蛋白或調(diào)控途徑是物種間保守的, 就可能利用模式生物來進(jìn)行研究。目前，已經(jīng)有許多成功的線蟲病理模型，如：溶酶體病，阿爾茨海默癥 (Alzheimers, AD)，多囊腎病 (polycystic k

5、idney disease)，Duchenne 肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，過氧化物體生物合成缺陷等。甲基磺酸乙酯，簡(jiǎn)稱EMS，是一種重要的致癌物之一，生物學(xué)上可以用來創(chuàng)建突變體庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)就是將EMS作為誘變劑來獲得線蟲的突變體。線蟲有單基因突變形成的表型，例如：運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成這些表型的基因有很多個(gè)，分別分布于各條染色體上。這些易于觀察的表型作為遺傳標(biāo)記，給線蟲的經(jīng)典遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來了極大的便利。此外，線蟲還有許多組織特異性標(biāo)記的品系，如在線蟲中負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)前后運(yùn)動(dòng)的D型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。我們通過對(duì)排卵時(shí)期的線蟲進(jìn)行誘

6、變，觀察誘變后線蟲突變體表形，對(duì)突變體后代進(jìn)行篩選，探究影響突變型基因的顯隱性，最終獲得能夠穩(wěn)定遺傳的突變體。2.材料和方法2.1 材料、試劑和器材實(shí)驗(yàn)材料：N2型秀麗隱桿線蟲。實(shí)驗(yàn)試劑：NGM（Nematode Growth Media）固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、M9線蟲生理溶液。實(shí)驗(yàn)器材：培養(yǎng)皿、報(bào)紙、錐形瓶（500ml、300ml、100ml）、15ml離心管、藍(lán)槍尖、黃槍尖、Ep管、5ml的塑料試管、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機(jī)、酒精燈、移液槍（1000ml、200ml）。2.2 方法2.2.1儀器的洗滌、包裝與滅菌，相關(guān)溶液的配制。（1）儀器的洗滌與包裝用自來水洗滌55mm培養(yǎng)皿（我們組

7、一次性洗12個(gè)培養(yǎng)皿），晾干后用報(bào)紙包裝好，以待滅菌。洗滌500ml錐形瓶，300ml錐形瓶，100ml錐形瓶，15ml離心管若干，錐形瓶裝入液體后，用錫紙封口，15ml離心管用報(bào)紙包好，以待滅菌。將藍(lán)槍尖和黃槍尖塞入槍尖盒，用報(bào)紙包裝好以待滅菌。將Ep管和5ml的塑料試管管放入玻璃瓶中，用報(bào)紙封口，以待滅菌。（2）相關(guān)溶液的配制NGM（Nematode Growth Media）固體培養(yǎng)基的配置按表1配置NGM固體培養(yǎng)基表1NGM固體培養(yǎng)基的配方NGM固體培養(yǎng)基150ml400mlNaCl0.45g1.2gagar2.6g6.8gtyptone0.375g1.000gdH2O146ml390

8、ml120滅菌15分鐘，然后在無菌的條件下加入下列滅菌的溶液CaCl2(1M)0.15ml0.40mlMgSO4(1M)0.15ml0.40ml磷酸緩沖液(1M)Ph63.75ml10ml膽固醇（1.5g/ml）0.15ml0.40mlLB液體培養(yǎng)基的配置按表2配置LB液體培養(yǎng)基表2LB液體培養(yǎng)基的配方LB液體培養(yǎng)基200mltyptone2gyeast1gNaCl1gdH2O200ml 120滅菌15分鐘M9線蟲生理溶液的配置按表3配M9線蟲生理溶液表3 M9線蟲生理溶液的配方M9線蟲生理溶液500mlKH2PO41.5gNa2HPO4,3gNaCl2.5gdH2O500ml 120滅菌15

9、分鐘MgSO4(1M)0.5ml(3)儀器與溶液的滅菌打開高壓蒸汽滅菌鍋，設(shè)置滅菌溫度120和滅菌時(shí)間10分鐘，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥，高壓鍋繼續(xù)升溫，自動(dòng)滅菌。在壓力降到0.5MPa，可緩慢放出蒸氣。當(dāng)壓力降到零后，才能開蓋，取出滅菌物品。2.2.2傾倒NGM平板，搖菌與鋪板（1）傾倒NGM平板紫外滅菌無菌操作臺(tái)5分鐘。雙手用酒精消毒之后，點(diǎn)燃酒精燈。待固體培養(yǎng)基冷卻至60，在酒精燈附近逐一傾倒平板，保證每個(gè)平板有NGM固體培養(yǎng)基約10ml。在培養(yǎng)皿皿蓋上做好標(biāo)記（包括組名，日期），待NGM固體培養(yǎng)基冷卻后，如果不用菌液鋪板，就用

10、封口膜封口后倒置于4冰箱保存，如果菌液已經(jīng)活化，則可直接鋪板。（2）菌種的活化與鋪板紫外滅菌無菌操作臺(tái)5分鐘。雙手用酒精消毒之后，點(diǎn)燃酒精燈。取出兩管高壓后的15ml離心管，用移液槍吸取液體配養(yǎng)基3ml,加入原始的OP50菌液300l，過夜搖菌。取200300l活化的菌液均勻地鋪在NGM固體培養(yǎng)基里，用手搖動(dòng)晃勻菌液，封口膜封口后，平置于操作臺(tái)上待菌液被吸收。等菌液被NGM固體培養(yǎng)基吸收后（一般20分鐘），在37培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，等細(xì)菌長(zhǎng)出薄薄的一層（一般12-24hr）即可接線蟲或倒置放在4冰箱保存。搖菌剩余的菌種可以與甘油1比1混合，顛倒搖勻，至于-20保存。2.2.3.懷卵成蟲的同步化（1

11、）選擇一個(gè)含有大量懷卵成蟲的培養(yǎng)皿，用3mlM9洗下，放入5ml的塑料試管，加入0.8ml20%次氯酸鈉，0.4ml0.5M的NaOH（事先配置次氯酸鈉和NaOH各1ml）。10min后，蟲體破裂，溶液變澄清。（2）3000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清。（3）4mlM9，混勻，3000rpm，離心1min，棄上清。（4）重復(fù)步驟（3）23次以去除殘留的裂解液。（5）加入0.2ml M9，混勻。（6）將液體接種于NGM上，20培養(yǎng)，約56hr達(dá)到L4或20培養(yǎng)24hr,轉(zhuǎn)至25培養(yǎng)大約21-22hr達(dá)到L4。2.2.4.EMS誘變和突變體篩選（1）無菌條件下，將培養(yǎng)皿中處于L4早期的雌雄同體線蟲用5m

12、l M9懸浮，用移液器轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。（2）1000rpm離心30s，去除上清，加入2mL M9。（3）另取一只離心管，加入M9 2ml以及20l EMS，擰緊蓋子，振蕩混勻。（4）2mL 含線蟲M9倒入2mL 含EMS M9 中，混勻，用封口膜密封。（5）室溫放置45 h，混勻30min。（6）1000rpm離心30s，去除上清，加入3-4mL M9清洗。（7）重復(fù)（6）34次。（8）自然沉淀，去上清，留下1mL 連同蟲子轉(zhuǎn)入NGM板上,每一個(gè)NGM板上加200ul，20培養(yǎng)2天后至產(chǎn)卵，移去成蟲；（9）繼續(xù)20培養(yǎng)若干天后連續(xù)觀察，篩選能夠穩(wěn)定遺傳的突變體及突變體的子代。3.結(jié)果在4（

13、或10）顯微鏡下觀察到的線蟲突變體和對(duì)照組如圖所示。3112111113.1運(yùn)動(dòng)軌跡變化突變體411511圖一 運(yùn)動(dòng)軌跡變化突變體的篩選圖一所示的是運(yùn)動(dòng)軌跡變化的突變體。圖1是野生型線蟲的運(yùn)動(dòng)軌跡，設(shè)為對(duì)照組，圖2至圖5是突變后線蟲的運(yùn)動(dòng)軌跡，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。圖2的運(yùn)動(dòng)軌跡較野生型相比更為平緩，圖3的運(yùn)動(dòng)軌跡較野生型相比更為陡峭，而圖4突變體的運(yùn)動(dòng)軌跡呈麻花狀，圖5突變體的運(yùn)動(dòng)軌跡極不規(guī)則并且十分糾結(jié)。這些都是可能是線蟲的突變體，但我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)軌跡奇怪的突變體的子代軌跡又往往正常化了，我們做了如下推測(cè)：運(yùn)動(dòng)軌跡的突變體是不可遺傳的，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)軌跡突變體可能是由環(huán)境決定的，或者是線蟲發(fā)生體細(xì)胞突變引

14、起的；運(yùn)動(dòng)軌跡的突變體發(fā)生的突變可能是隱形突變，因此在后代所占比例太少，而且運(yùn)動(dòng)軌跡在蟲子太多的時(shí)候又難以觀察，所以難以獲得穩(wěn)定的運(yùn)動(dòng)軌跡奇怪的穩(wěn)定遺傳的突變體；運(yùn)動(dòng)軌跡奇怪的線蟲本身并沒有發(fā)生突變，可能是由于自身興奮而產(chǎn)生了奇怪的運(yùn)動(dòng)軌跡。6543213.2形態(tài)特征變化突變體圖二形態(tài)特征變化突變體的篩選圖二是形態(tài)特征變化的突變體。圖1是野生型成體期線蟲的形態(tài)特征，設(shè)為對(duì)照組，圖2至圖6是突變后線蟲的形態(tài)特征，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。圖2是嚴(yán)重卷曲，極少移動(dòng)的成體期線蟲突變體，圖3是背部長(zhǎng)小泡的成體期線蟲突變體，圖4是身體細(xì)長(zhǎng)，并且頭尾很尖的L4期線蟲突變體，圖5是短粗的成體期線蟲突變體，圖6是只能向左轉(zhuǎn)

15、彎的成體期運(yùn)動(dòng)障礙突變體。其中，在這幾種突變體中，身體細(xì)長(zhǎng)，并且頭尾很尖的突變體和向左轉(zhuǎn)彎的運(yùn)動(dòng)障礙突變體是可遺傳的顯性突變體，其他幾種突變體的后代都是野生型形態(tài)的線蟲，不是穩(wěn)定的突變體。4.討論（1）使用高壓蒸汽滅菌鍋時(shí)，一開始當(dāng)壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后（也可以在5分鐘之后），再關(guān)閉放氣閥，以完全排除鍋內(nèi)空氣，使滅菌才能徹底。（2）滅菌完后，如果時(shí)間緊急，可在壓力降到0.5MPa，可緩慢放出蒸氣。當(dāng)壓力降到零后，才能開蓋，取出滅菌物品。（3）所配置的液體培養(yǎng)基高壓后要分裝在幾個(gè)小量程的錐形瓶中，這樣如果操作過程中液體培養(yǎng)基被污染，可防止配置的液體培

16、養(yǎng)基全被污染。（4）搖菌的時(shí)候一種菌搖兩管，這樣可以保證如果一管菌的菌種引入了雜菌，另一管菌液如果沒被污染就還能用。（5）無菌操作臺(tái)在使用前應(yīng)該先紫外滅菌5分鐘，操作之前雙手也應(yīng)該用酒精消毒，以防止操作過程中造成實(shí)驗(yàn)污染。（6）細(xì)菌要倒置培養(yǎng)，防止水蒸氣滴到固體培養(yǎng)基上，影響微生物的生長(zhǎng)、線蟲的運(yùn)動(dòng)和雜菌污染。（7）在用菌液鋪板時(shí)，如果培養(yǎng)的是野生型線蟲，為了讓線蟲均勻地在培養(yǎng)基上大量生長(zhǎng)，需要均勻地鋪板，如果是觀察誘變體，則將菌液集中滴在中間，使線蟲集中生長(zhǎng)，利于觀察突變體。（8）在做同步化的時(shí)候，一定要觀察到培養(yǎng)皿上有大量化卵成蟲再做同步化，不然得到的同步化的蟲子會(huì)特別少。（9）如果同步化

17、得到的蟲子很少，有兩種方法補(bǔ)救：找一個(gè)含有大量化卵成蟲的皿再做同步化；在野生型線蟲培養(yǎng)基上選取一塊線蟲生長(zhǎng)時(shí)期相同的區(qū)域，挖下來，接到新的培養(yǎng)基上，多挖幾塊繼續(xù)培養(yǎng)，這樣數(shù)小時(shí)后得到的蟲子基本還應(yīng)該是同一時(shí)期的。在做同步化的時(shí)候可以多同步化幾個(gè)板，這樣如果一個(gè)板同步化失敗了，還會(huì)有一個(gè)板可以補(bǔ)救。（10）誘變過程中一定要將EMS洗干凈，否則誘變時(shí)間太長(zhǎng)，線蟲會(huì)死掉。（11）一定要讓菌在37培養(yǎng)箱里鋪滿再接線蟲(一般616個(gè)小時(shí))，否則容易在挑突變體的過程中造成雜菌污染，如果op50在培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿了，就會(huì)形成優(yōu)勢(shì)菌種，這樣就很難造成雜菌污染。（12）當(dāng)菌長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的時(shí)候，若不立即接種，可以在4倒

18、置放置一段時(shí)間，但不要放置時(shí)間過長(zhǎng)，原因如下：菌的壽命也有限，時(shí)間越長(zhǎng)，菌的活性越低；菌的尸體會(huì)影響對(duì)線蟲的觀察。（13）Op50所生長(zhǎng)的NGM固體培養(yǎng)基是沒有加氨芐的，操作不當(dāng)容易長(zhǎng)菌。長(zhǎng)菌的板容易使線蟲誘變，所以在超凈臺(tái)上操作的時(shí)候一定要注意不要污染。（14）在找突變體之前可以先觀察突變體線蟲的樣板，對(duì)照著樣板的突變體找誘變的突變體，找到突變體之后再將其與野生型突變體對(duì)比，以確認(rèn)找到的突變體是否典型。（15）找突變體的時(shí)候在解剖鏡下找，這樣好挑線蟲，挑線蟲的時(shí)候要用灼燒過又冷卻至室溫的的pick挑，以免污染培養(yǎng)基。觀察突變體線蟲的時(shí)候在顯微鏡下觀察。（16）剛從培養(yǎng)箱或冰箱里拿出來的培養(yǎng)基

19、上可能有少許水，可先將其在桌面上倒置一會(huì)兒再使水流到培養(yǎng)皿皿蓋，然后再用火烤烤皿蓋將水烤干，倘若培養(yǎng)皿上水汽太多，剛剛接入的線蟲會(huì)成游泳狀運(yùn)動(dòng)，讓人誤以為是突變體。（17）整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中要估計(jì)好線蟲生長(zhǎng)時(shí)間，在20，線蟲的生長(zhǎng)周期大約是4天，如果沒有及時(shí)挑突變體，可以根據(jù)線蟲的生長(zhǎng)周期推斷挑的突變體是F1代突變體還是F2代突變體等，不過這種方法也不能保證誘變的培養(yǎng)基中的突變體是第幾代，因?yàn)榛蛲蛔円部梢允亲园l(fā)產(chǎn)生的。因此，培養(yǎng)基一定要事先配好，不要誤了挑選突變體的時(shí)間，這樣才能一步步地篩選能夠穩(wěn)定遺傳的突變體。（18）挑完突變體一定要找同時(shí)期的野生型線蟲在同一顯微鏡下作對(duì)比，這樣可以確保找到的

20、突變體是否真的與野生型不同，在進(jìn)行對(duì)比的時(shí)候不要反復(fù)地調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，因?yàn)樵谡{(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生視覺誤差，就算是同一只線蟲在轉(zhuǎn)換細(xì)準(zhǔn)焦螺旋觀察的時(shí)候也會(huì)覺得粗細(xì)有所變化。（19）在觀察運(yùn)動(dòng)障礙的突變體時(shí)，只有細(xì)心觀察才能找到運(yùn)動(dòng)障礙的突變體，我們找到的只能向左轉(zhuǎn)彎的運(yùn)動(dòng)障礙突變體就需要長(zhǎng)時(shí)間的觀察才能找到，它的頭部總是在搖擺，當(dāng)感覺要向右運(yùn)動(dòng)時(shí)就突然停止運(yùn)動(dòng)，而是向后退，但是大多數(shù)情況，這種線蟲會(huì)向左運(yùn)動(dòng)。（20）長(zhǎng)菌的培養(yǎng)皿容易誘變出氣泡的突變體，由于這種形狀是環(huán)境誘導(dǎo)的，很可能是不可遺傳的突變，因此，長(zhǎng)泡線蟲的后代幾乎觀察不到身體上有小泡的線蟲。（21）本實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性強(qiáng)、時(shí)間跨度大，因此要注意每步實(shí)驗(yàn)操作，避免出現(xiàn)錯(cuò)誤（如沒有無菌操作、沒有及時(shí)挑取突變體等），否則就會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。（22）長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基并不影響線蟲生長(zhǎng)，只是影響線蟲觀察影響，盡管少數(shù)時(shí)候會(huì)誘導(dǎo)長(zhǎng)泡型的突變體產(chǎn)生，但是千萬(wàn)不能因此去用pick挑走菌落，這樣不但會(huì)使培養(yǎng)基里長(zhǎng)出更多因挑菌而產(chǎn)生的分散的菌落，還極有可能將隱藏在菌里面的線蟲突變體或卵挑走。我們實(shí)驗(yàn)最后突變體的培養(yǎng)皿中只能觀察到很少的突變體可能就是這