X射線晶體衍射測定蛋白質三維結構

1、蛋白質結構測定,2011-3-30,蛋白質三維結構測定方法及數(shù)量,蛋白質三維結構測定年增長圖,第一節(jié)：X-射線衍射技術用于蛋白質晶體結構測定,原理 基本過程 優(yōu)缺點 應用實例,一、相關原理,光的衍射現(xiàn)象 X射線的發(fā)現(xiàn)及應用 本質的爭論 X射線衍射的發(fā)現(xiàn) 晶體學基礎知識 X射線晶體衍射,?,光線拐彎了！,1.光的衍射現(xiàn)象,衍射現(xiàn)象：光波偏離直線傳播而出現(xiàn)光強不均勻 分布的現(xiàn)象,當縫的大?。ɑ蛘系K物的大?。└ㄩL相差不多時就發(fā)生明顯的衍射現(xiàn)象如果縫很寬，其寬度遠大于波長，則波通過縫后基本上是沿直線傳播的，衍射現(xiàn)象就很不明顯了,惠更斯菲涅耳原理,菲涅耳補充：從同一波陣面上各點發(fā)出的子波是相干波。 1

2、818年,惠更斯：光波陣面上每一點都可以看作新的子波源，以后任意時刻，這些子波的包跡就是該時刻的波陣面。 1690年,解釋不了光強分布！,2. X射線的發(fā)現(xiàn)歷程及應用,失之交臂 1836 法拉第 發(fā)現(xiàn)陰極射線 1861 克魯克斯 陰極射線管在放電時會產生亮光 干版和光片有問題？ 1890 古德斯柏德 洗出了一張X射線的透視底片 照片的沖洗藥水或沖洗技術 發(fā)現(xiàn)X射線 本質的爭論 X射線衍射,2.X射線的發(fā)現(xiàn)及應用,1895年 倫琴（Roentgen）發(fā)現(xiàn)故稱為倫琴射線。,倫琴夫人的手的X射線照片,X射線在醫(yī)學上的應用,倫琴的新發(fā)現(xiàn)轟動了全世界, 不到三個月, 維也納的一家醫(yī)院便拍出了應用于醫(yī)療的

3、X射線照片.從此, X射線拍片和射線透視成為醫(yī)學診療中常用的手段。 為了防止各臟器成像發(fā)生的重疊給診療帶來不便, 科學家們進一步研究了成像更清晰、靈敏度更高的儀器。1972年，英國科學家漢斯菲爾德運用計算機和圖像重建理論, 制成了電子計算機射線斷層掃描成像裝置, 也就是已被廣泛應用的CT。,X射線與諾貝爾獎物理學獎,倫琴因發(fā)現(xiàn)X射線而獲得第一屆諾貝爾物理學獎。 1903 年諾貝爾物理學獎。 1906 年的諾貝爾物理學獎。 勞厄獲得了1914 年諾貝爾物理學獎。 英國的布拉格父子1915 年的諾貝爾物理學獎。 英國的巴克拉1917 年的諾貝爾物理學獎。 瑞典物理學家西格班1924 年諾貝爾物理學

4、獎。 美國的康普頓1927 年諾貝爾物理學獎。 前蘇聯(lián)的切連科夫1958 年諾貝爾物理學獎; 美國的霍夫斯塔特1961 年諾貝爾物理學獎; 瑞典的西格巴恩1981 年的諾貝爾物理學獎。,化學獎,荷蘭的物理化學家德拜1936 年諾貝爾化學獎。 美國著名化學家鮑林1954 年諾貝爾化學獎。 英國生物學家肯德魯與佩魯茨1962 年諾貝爾化學獎。 英國女化學家霍奇金1964 年諾貝爾化學獎。 美國化學家利普斯科姆1976 年諾貝爾化學獎。 英國化學家桑格和美國化學家吉爾伯特1980 年諾貝爾化學獎。 英國生物化學家克盧格因1982 年諾貝爾化學獎; 美國化學家豪普特曼和卡爾1985 年諾貝爾化學獎;

5、1988 年,米歇爾等三位德國生物化學家諾貝爾化學獎。,3.X射線本質的爭論,X射線本質的爭論-波動說,巴克拉： X射線波動性 標識譜線：不管元素已化合成什么化合物，它們總是發(fā)射一種硬度的X射線，當原子量增大時，標識X射線的穿透本領會隨著增大。這說明X射線具有標識特定元素的特性。,X射線本質的爭論微粒說,X射線微粒論者 粒子具有旋轉性,布拉克父子,4.X射線衍射,X射線衍射的獲得,波長范圍：100.1埃 欲觀察其衍射現(xiàn)象則衍射線度應與其波長差不多，晶體的晶格常數(shù)恰是這樣的線度 衍射波的兩個基本特征衍射線（束）在空間分布的方位（衍射方向）和強度與晶體內原子分布規(guī)律（晶體結構）密切相關。,X射線晶

6、體結構分析？ 使用X射線作為物理工具，依賴X射線衍射現(xiàn)象為物理原理，以晶體作為研究對象，晶體結構作為研究結果的一種分析方法。,5.X射線的獲得：,X射線管,激光等離子體,同步輻射,X射線激光,6.晶體基礎,什么是晶體 晶體的周期排布 晶體的對稱性,3.1什么是晶體,固體物質 晶體 相當罕見的東西？ 非晶體 晶體(Crystal ) 指離子、原子或分子這些微粒在三維空間中周期性重復排列形成的、能夠給出明銳衍射的固體結構。,晶體什么樣（1）,晶體什么樣（2）,晶體什么樣（3）,晶體什么樣（4）,2.晶體和點陣結構,晶體的周期性結構使得我們可以把它抽象成“點陣”來研究. 一維周期性結構與直線點陣 二

7、維周期性結構與平面點陣 三維周期性結構與空間點陣,一維周期性結構與直線點陣,二維周期性結構與平面點陣,三維周期性結構與空間點陣,晶胞(Unit cell) 空間點陣的單位（大小和形狀完全相同的平行六面體），是晶體結構的最小單位。 同一個空間點陣，劃分平行六面體的方式是多種多樣的。 選擇平行六面體的原則： 所選平行六面體的對稱性應符合整個空間點陣的對稱性。 選擇棱與棱之間直角關系為最多的平行六面體 所選平行六面體之體積應最小。 當對稱性規(guī)定棱間的交角不能為直角關系時，應選擇結點間距小的行列作為平行六面體的棱，且棱間的交角接近于直角的平行六面體。,單位平行六面體，a、b、c 、 是表征它本身形狀、

8、大小的一組參數(shù)，稱為格子參數(shù)或點陣參數(shù)。,單位平行六面體與坐標軸的關系：棱交角坐標軸之間交角。 a、b、c 軸單位。 a、b、c、 關系有七種情況，與單位平行六面體七種格子相對應。,立方格子 a=b=c = =90o,三方格子 a=b=c = 90o， 60， 109o2816 ,菱面體格子中為特殊角度時，演變成的三種立方體格子,四方格子 a=b c = =90o,六方格子 a=bc =90o =120o,正交格子 a b c = =90o,單斜格子 a b c = =90o 90o,三斜格子 a b c 90o,按結點位置，可有四種不同的類型：,P 原始格子（角頂）,C 底心格子（角頂、頂?shù)?/p>

9、面）,I 體心格子（角頂、體心）,F 面心格子（角頂、每個面）,P 原始格子（角頂）,C 底心格子（角頂、頂?shù)酌妫?I 體心格子（角頂、體心）,F 面心格子（角頂、每個面）,結構中代表各類等同點的結點在空間的排列方式來說，格子的種類有、且只有十四種。,衍射方向,二、X射線晶體結構測定基本過程,蛋白質獲?。ㄌ峒儯?晶體生長并經冷凍技術處理 重原子衍生物制備 衍射數(shù)據(jù)收集 衍生數(shù)據(jù)分析和改進 結構模型的獲取（包括修正）,（2）晶體生長過程及影響因素,晶核（盡量少） 微晶（可用作晶種） 晶體在數(shù)小時至數(shù)月后出現(xiàn) 2個問題： 是鹽晶嗎？ 能給出有用的衍射嗎？（多晶/雙晶）,影響因素 物理因素：溫度、壓

10、力、震動、溶劑清潔度、試劑純度、重力、外加物理場等 生物化學因素：pH、離子強度、沉淀劑/添加劑的類型和濃度等 其他：溶液過飽和度、純度等 “經驗” “機器人”,（2）晶體生長過程及影響因素,（3）結晶方法,批量結晶法 batch crystallization 透射法 crystallization by dialysis 液相擴散法 liquid diffusion 氣相擴散法vapor diffusion 氫氘交換質譜技術 Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, DXMS 生物玻璃bioglass,（4）晶

11、體的初步鑒定,（5）衍射數(shù)據(jù)收集,晶體的處理：低溫液氮氣冷流技術 數(shù)據(jù)收集儀：底片、面探測器,衍射分析儀器的發(fā)展,射線種類：連續(xù)射線 特征射線 電子衍射 中子衍射,探測技術：膠片 閃爍體計數(shù)器（點） （IP）CCD探測器（面）,圖2-22 石英的衍射儀計數(shù)器記錄圖（部分） *右上角為石英的德拜圖，衍射峰上方為（hkl）值，代表K衍射,底片（外森堡相機、徘循相機）,優(yōu)點： 多點同時收集 容易保存 價格便宜 缺點 存在“化學霧”背景和X射線散射背景 費時、費力,計數(shù)管（四圓衍射儀）,將X射線光子強度轉換為電信號，信號放大后再轉換成數(shù)字存入計算機隨時調用 逐點收集數(shù)據(jù) 優(yōu)缺點與底片相反,面探技術-S

12、MART APEX-CCD衍射儀,Smart CCD Overview,SMART APEX-CCD探測器,金屬絲構成的面板，可同時多點收集 將X射線光子強度轉換為電信號 集計數(shù)管的精確和底片的多點收集效率,面探技術-SMART APEX-CCD衍射儀,圖像板image plate,面探測器的改進 由化學材料構成，整塊板子密度一致 高分辨率 可見光下可測量 集底片和面探測器的優(yōu)點于一身,（6）數(shù)據(jù)分析,電子密度修飾 電子密度圖詮釋 結構模型精化 數(shù)據(jù)處理軟件：Denzo, Scalepack,三、X射線晶體結構測定優(yōu)點,分辨率高 不損傷樣品 無污染 相對快捷 能得到晶體完整性的大量信息,晶體構

13、象是靜態(tài)的，不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構象； 很多蛋白質很難結晶，或者很難得到用于結構分析的足夠大的單晶；（瓶頸） X射線晶體衍射的工作流程較長。,四、X射線晶體結構測定存在問題,Last update: Tuesday Oct 20, 2009 at 5 PM PDT,于1971年和1972年分別得到分辨率為2.5埃和1.8埃的豬胰島素晶體測定，這是中國闡明的第一個蛋白質的三維結構。,豬胰島素(蛋白質編號4ins)的兩條小鏈,“中國蛋白質晶體學研究水平和世界發(fā)達國家一樣高！ 胰島素晶體最好的電子密度圖在北京，不在牛津。” 多蘿西霍奇金 ，1972,五、應用實例1.胰島素,2.菠菜捕光蛋白LHC II（膜、疏水，2.72）Nature, 2004, Mar.,LHC-II是綠色植物中含量最豐富的主要捕光復合物，這種復雜的分子體系鑲嵌在生物膜中，具有很強的疏水性，難以分離和結晶。對其晶體結構的測定是國際公認的高難課題，也是一個國家結構生物學研究水平的重要標志