第五章 目的基因的獲取、擴(kuò)增與檢測(cè)及相關(guān)技術(shù)-之3檢測(cè)-zhl2-已修.ppt

1、第五章 目的基因的獲取、擴(kuò)增 與檢測(cè)及相關(guān)技術(shù),1、物理化學(xué)方法 2、鳥(niǎo)槍法 3、化學(xué)合成法 4、基因文庫(kù) 5、逆轉(zhuǎn)錄合成 6、 PCR技術(shù) 7、凝膠電泳 8、酵母雙雜交系統(tǒng) 9、雜交技術(shù) 10、生物芯片 11、 DNA測(cè)序,基因的獲得,基因的擴(kuò)增,基因的檢測(cè),第三節(jié) 目的基因的檢測(cè)技術(shù),一、凝膠電泳 二、 PCR技術(shù) 三、雜交技術(shù) 四、DNA測(cè)序 五、酵母雙雜交系統(tǒng) 六、生物芯片,一、凝膠電泳（已講） 二、 PCR技術(shù)（已講）,核酸分子雜交（DNA/DNA or DNA/RNA）技術(shù) 核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（Cavnegie Institute of Washin

2、gton）的Roy Britten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。,三、雜交技術(shù),1、原理 2、分類(lèi) 3、雜交過(guò)程,三、雜交技術(shù),1、原理,（1）核酸分子間雜交 ： 在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。 （2）蛋白質(zhì)間雜交： 抗原-抗體免疫反應(yīng),復(fù)性,RNA,DNA,靶蛋白（抗原）,抗體,抗抗體,（1） Souther

3、n印跡雜交 (Southern blotting) DNA-DNA,（2） Northern印跡雜交 (Northern blotting) RNA-DNA,（3） Western印跡雜交 (Western blotting) 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),2、分類(lèi),（4）菌落原位雜交 (in situ hybridization) DNA-菌落DNA, 核酸雜交： （基于堿基互補(bǔ)配對(duì)） 蛋白質(zhì)雜交：Western雜交,Southern雜交 Northern雜交 菌落原位雜交,其他： 組織原位雜交(Tissue in situ hybridization) DNA-染色體DNA 斑點(diǎn)雜交(印跡) (dot

4、blotting) DNA-DNA(直接點(diǎn)樣雜交) DNA點(diǎn)陣、生物芯片,DNA點(diǎn)陣,（1） Southern印跡雜交,（2） Northern印跡雜交,（3） Western印跡雜交,3、雜交過(guò)程,（4）菌落原位雜交,* 是E.Southern 于1975年創(chuàng)建用以鑒定DNA中某一特定的基因片段的技術(shù)，也稱(chēng)為Southern印跡（Southern Blotting）。 * 通過(guò)標(biāo)記的探針DNA與靶DNA結(jié)合，檢測(cè)目的基因的存在及大小。,（1）Southern雜交,探針（probes）:根據(jù)所需基因的核苷酸順序制成一段與之互補(bǔ)的核苷酸短鏈，并用同位素標(biāo)記,Southern印跡法,DNA分子,限

5、制片段,限制性酶切割,瓊脂糖電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,與放射性標(biāo)記DNA探針雜交,放射自顯影,帶有DNA片段的凝膠,凝膠,濾膜,用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA,吸附有DNA片段的膜,Southern 凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù),Southern DNA 印跡雜交之X光顯像圖片 水稻（Oryza sativa L.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽(yáng)性條帶 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,放射自顯

6、影照片,（2）Northern雜交,* 也稱(chēng)為Northern印跡（Northern Blotting），用以檢測(cè)某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達(dá)量。 * 因與DNA的雜交（Southern 雜交）相對(duì)應(yīng)，故被趣稱(chēng)為Northern雜交。,（3）Western(印跡)雜交,* 蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱(chēng)為免疫印跡，即檢測(cè)蛋白質(zhì)與標(biāo)記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達(dá)量。 * 與DNA、RNA水平上的Southern雜交、Northern雜交相對(duì)應(yīng)，稱(chēng)為Western雜交。 * 常結(jié)合Northern印跡技術(shù)，檢測(cè)基因表達(dá)調(diào)控。,Southe

7、rn和Western印跡法,DNA frangment,Electrophoresis,Transfer of DNA by blotting,32P-labled DNA probe,Autoradiography,Agarrose gel,Autoradiogram,Nitrocellulose sheet,Autoradiogram,Polymer sheet,SDS-Polyacrylamide gel,Transfer protein,Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody,Protein b

8、and detected by specific antibody,Autoradiography,三種印跡技術(shù)的比較,（4）菌落原位雜交,* 細(xì)胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。 * 細(xì)菌菌落的原位雜交：篩選陽(yáng)性克隆。,菌落雜交 也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。 鑒定重組子。,原位雜交法篩選DNA重組體圖解,復(fù)印至硝酸纖維素膜上,用NaOH菌體裂解DNA變性,雜交,放射自顯影,32P-cDNA,與放射性cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn),細(xì)菌菌落,單鏈DNA結(jié)合到膜上,檢測(cè)重組

9、體克隆的菌落雜交技術(shù),菌落原位雜交,第一節(jié) 分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Blotting Technology,探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,雜種核酸分子： 彼此退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，而形成的雙鏈分子。 DNA/DNA的雜交作用 檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間的親源關(guān)系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。,核酸雜交常用幾種膜的性能比較,硝酸纖維素膜 不能滯留小于150bp的DNA片斷，不

10、能同RNA結(jié)合。 應(yīng)用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對(duì)小片斷DNA的滯留能力。 RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。,尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： 1. 核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細(xì)管作用 2. 印跡雜交： 將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的DNA/RNA進(jìn)行雜交。,1、 Southern(薩瑟恩)DNA印跡雜交 根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.S

11、outhern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故又叫Southern DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。,印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理： 分子量不同所需轉(zhuǎn)移的時(shí)間不同； 浸泡在0.25M的HCL溶液中脫嘌呤，再進(jìn)行堿變性 堿水解，DNA鏈斷裂 單鏈,Southern 凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù),Southern DNA 印跡雜交之X光顯像圖片 水稻（Oryza sativa L.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的

12、陽(yáng)性條帶 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,在進(jìn)行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時(shí)， 1. 要將以轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤12小時(shí)； 2. 紫外線(xiàn)交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團(tuán)之間進(jìn)行交聯(lián)。,2、 Northern(諾賽恩)RNA印跡技術(shù)（Northern blotting） 1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類(lèi)似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northern blotting）。 而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做Western(韋斯頓)蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Western blotting）。,蛋白質(zhì)/DNA、蛋白質(zhì)/RNA雜交技術(shù),凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gel retardation assay） 又叫DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay），是在