食品中細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定

1、菌落總數(shù)的測(cè)定 (GB 4789.22010),一、 目的 1、學(xué)習(xí)并掌握食品中菌落總數(shù)測(cè)定方法和原理。2、了解菌落總數(shù)測(cè)定在對(duì)被樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)中的意義 。,二、原理,細(xì)菌數(shù)量的表示方法由于所采用的計(jì)數(shù)方法不同而有兩種：菌落總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)。,1、菌落總數(shù) 是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1mL檢樣中形成的細(xì)菌菌落總數(shù)。以 CFU/g（mL）來表示。 一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、是否需要氧氣等。,按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下， 36 1培養(yǎng)482 h，能在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)菌菌落總數(shù)。所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，

2、由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長(zhǎng)。,菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，也不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，只包括一群在計(jì)數(shù)平板瓊脂中生長(zhǎng)發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。,2 菌落總數(shù)測(cè)定的衛(wèi)生學(xué)意義 （1）菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。,（2） 食品中細(xì)菌菌落總數(shù)越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質(zhì)量越差；菌落總數(shù)越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗(yàn)，才能對(duì)食品做出較全面的評(píng)價(jià)。,3、細(xì)菌總數(shù) 指一定數(shù)量或面積

3、的食品樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，在顯微鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1 g或1 mL樣品中的細(xì)菌總數(shù)來表示。,三、材料,1、食品檢樣 2、培養(yǎng)基 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液 3、其它 無(wú)菌培養(yǎng)皿，無(wú)菌吸管，電爐、恒溫培養(yǎng)箱等。,四、流程,1、檢樣 2、做幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液 3、選擇23個(gè)適宜稀釋度各1 mL,分別加入滅菌平皿內(nèi) 4、平皿內(nèi)傾注1520 mL瓊脂培養(yǎng)基，混勻 5、36 1培養(yǎng)482小時(shí)或（242）小時(shí) 6、記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的各平板菌落數(shù)量 7、 計(jì)算菌落總數(shù) 報(bào)告,五、步驟,(一)取樣、稀釋和培養(yǎng)

4、 1、以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），放于225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液 的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振蕩或研磨制成1:10的均勻稀釋液。 固體和半固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以800010000r/min的速度處理12min，制成1:10的均勻稀釋液。,2、用1 mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的試管內(nèi)，振搖試管或反復(fù)吹打混合均勻，制成1:100的稀釋液。,3、另取1 mL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1 mL吸管。,4、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ?/p>

5、染情況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度，分別在制作10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。 同時(shí)分別取1ml稀釋液（不含樣品）加入兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。,5、稀釋液移入平皿后，將冷卻至46瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約1520ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。,6、待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置361溫箱內(nèi)培養(yǎng)482h，水產(chǎn)品301溫箱內(nèi)培養(yǎng)723h。 如樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4毫升），凝固后培養(yǎng)。,（二）菌落記錄方法 做平板菌落數(shù)記錄時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各

6、平皿的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。 到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不要超過24h。,1、平皿菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。每一個(gè)稀釋度應(yīng)采用兩個(gè)平皿，大于300的可記為多不可計(jì)。,2、其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，以代表一個(gè)平板的菌落數(shù)。,3、當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，如呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每

7、條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù)。,（三）菌落總數(shù)的計(jì)算 1、若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。,2、若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，應(yīng)以兩者比值決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告兩者的平均數(shù)；若大于等于2，則報(bào)告稀釋度較小的菌落數(shù)。,3、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。,4、若所有稀釋度平板菌落數(shù)均30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)計(jì)算。 5、若所有稀釋度平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算

8、。,6、若所有稀釋度均不在30300之間，有的300，有的又30，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。,（四）菌落計(jì)數(shù)報(bào)告方法,1、菌落數(shù)在1100時(shí)，按四舍五入報(bào)告兩位有效數(shù)字。 2、菌落數(shù) 100時(shí)，第三位數(shù)字按四舍五入計(jì)算，取前面兩位有效數(shù)字，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可以10的指數(shù)表示。,3、若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。 4、 若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。 5、稱重取樣以CFU/g 為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL 為單位報(bào)告。,注意事項(xiàng),1、無(wú)菌操作 操作中必須有“無(wú)菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子

9、等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無(wú)菌室進(jìn)行。,2、采樣的代表性 如系固體樣品，取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。,3、稀釋液 樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，或磷酸鹽緩沖液（或0.1蛋白胨水），后者對(duì)食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對(duì)含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。,4、每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。 5、傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46水浴內(nèi)保溫，溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)，過低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無(wú)

10、水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。,6、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從1220ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。,7、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。,8、培養(yǎng)溫度一般為37（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30）。培養(yǎng)時(shí)間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計(jì)數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不

11、應(yīng)超過15。,9、為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。,六、結(jié)果,1、將實(shí)驗(yàn)測(cè)出的樣品數(shù)據(jù)以表格的方式報(bào)告。 2、對(duì)樣品菌落總數(shù)作出是否符合衛(wèi)生要求的結(jié)論。,報(bào)告方式,七、思考,1、什么是細(xì)菌菌落總數(shù)（cfu）？2、細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定的衛(wèi)生學(xué)意義是什么？ 3、倒培養(yǎng)基后，為什么要倒置培養(yǎng)？ 4、為什么營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在使用前要保持在461的溫度？,醬油（GB/T2717-2003）： 細(xì)菌菌落總數(shù)： 30000 CFU/mL 大腸菌群： 30MPN/100mL 腸道致病菌： 不得檢出,全脂奶粉、脫脂奶粉（GB5410-1999）： 特級(jí) 一級(jí) 二級(jí) 細(xì)菌菌落總數(shù)：20000 30000 50000 （CFU/ml） 大腸菌群 40 90 90 （MPN/100g） 腸道致病菌： 不得檢出 不得檢出 不得檢出,巴氏殺菌乳（GB5408.1-1999） 細(xì)菌菌落總數(shù)： 30000 CFU/mL 大腸菌群： 90 MPN/100mL 腸道致病菌： 不得檢出,生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2006） 菌落總數(shù)cfu/ml： 100 總大腸菌群cfu/100m