流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡.ppt

1、研究細(xì)胞生命活動(dòng)的完整解決方案 -細(xì)胞凋亡,BD公司 李彩霞Caixia_,一個(gè)細(xì)胞的全面研究,BD 提供的技術(shù)方法,Flow Cytometry (FCM) Immunophenotyping Cytometric Bead Array (CBA System for multiplexed Immunoassays) Phosflow (cell signaling) ELISA (BD OptEIA) ELISPOT Cell Separation (BD Imag) Western Blots (WB) Immuno-Precipitation (IP) Im

2、muno-HistoChemistry (IHC) Immuno-Fluorescence (IF) direct link with BioImaging Function Assays (FA) Molecular Biology (MB) Protein Expression (BD Baculovirus Expression Vector) mRNA Detection (BD RiboQuant),Life and Death of the Cell,外在因素,內(nèi)在因素,分裂-細(xì)胞增殖,分化,維持現(xiàn)狀,壞死,凋亡,細(xì)胞凋亡概述,細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有

3、序的死亡。 細(xì)胞凋亡參與正常組織發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)過程。 病理狀態(tài): 癌癥 (正常的凋亡發(fā)生改變/下降） 神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏病和Alzheimers 疾病 病毒性疾病如 HIV 自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,細(xì)胞凋亡研究方法,研究方法: 流式細(xì)胞儀 酶聯(lián)方法 圖像 組織化學(xué) 基于DNA的方法 BD Pharmingen 有500多種研究凋亡的試劑: 抗體（針對凋亡蛋白） 試劑盒 抑制劑,細(xì)胞凋亡研究指標(biāo),細(xì)胞凋亡研究指標(biāo),凋亡相關(guān)細(xì)胞膜變化的檢測 凋亡相關(guān)酶活性的檢測 凋亡相關(guān)線粒體變化的檢測 凋亡相關(guān)DNA片段的檢測,Annexin V 檢測-細(xì)胞膜變化相關(guān)檢測,表面 marker 檢測細(xì)

4、胞膜的變化，與凋亡正相關(guān) 早期、快速確定凋亡的方法 需要用活的、沒有固定的細(xì)胞 方法 流式細(xì)胞術(shù) 免疫熒光技術(shù),Annexin V 檢測原理,Annexin V Data,BD Annexin V 流式試劑盒,提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500等多種熒光標(biāo)記的Annexin V以及純凈的Annexin V。,Annexin V檢測常見問題,是否 Annexin V kits 可以檢測小鼠或其他物種? Annexin V試劑盒可以檢測多種屬 這個(gè)試劑盒是否可用于貼壁細(xì)胞、固定或凍存的細(xì)胞、或組織? No. 上述樣

5、本的細(xì)胞細(xì)胞膜都會(huì)或多或少受到損害，這樣的樣本建議用免疫熒光技術(shù) (Cat. No. 550911) 是否與細(xì)胞表面標(biāo)記兼容? 只要Ca離子不影響該表面Marker就可以同時(shí)做.,凋亡相關(guān)酶的檢測-Caspase概述,凋亡蛋白酶是凋亡重要的起始因子。凋亡最早和最常檢測到的特征之一是一系列名為caspases的胞漿蛋白酶的激活。尤其是caspase-8、-9和-3都與凋亡有關(guān)。 Caspase-3在早期凋亡細(xì)胞中就已經(jīng)活化，是凋亡程序中的重要的Caspase酶?；罨腃aspase-3又水解、活化其它Caspase酶和多種胞漿內(nèi)成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核內(nèi)成分（如PARP）。,凋亡相

6、關(guān)酶的檢測-Caspases檢測方法,胞內(nèi) markers 凋亡進(jìn)行的標(biāo)志 (active caspase-3) 用固定細(xì)胞 檢測方法 ELISA 免疫熒光（熒光顯微鏡） 免疫組化 免疫沉淀 Flow Cytometry Western Blot,Caspase-3 data,Jurkat T-Cells Mouse Thymocytes,Caspase-3,PARP cleaved Caspase 3水解產(chǎn)物,Hela 細(xì)胞 A 未處理組 B星孢菌素處理組裂解的PARP陽性,Jurket細(xì)胞用不同濃度的喜樹堿處理結(jié)果,BD Caspase 流式檢測試劑盒,更多產(chǎn)品見Tools for ass

7、essing cell events Apoptosis, Cell Cycle, and Cell Proliferation Product list,線粒體膜電位檢測: JC-1,凋亡與線粒體膜電位的去極化相關(guān) 該染料在正常細(xì)胞中在胞漿以聚合體形式存在，在 Fl-1 和 Fl-2 有熒光 細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體膜電位發(fā)生去極化，JC-1 進(jìn)入線粒體以單體形式存在，僅在 Fl-1通道有熒光,BD Mitoscreen (JC-1) Data,JC-1 (Fl-1),Jurkat T Cells,Mouse Thymocytes,Control,Staurosporine,Camptothecin

8、,Fas mAb,R1,R2,R1,R2,R1,R2,R1,R2,R1,R2,R1,R2,Control,JC-1 (Fl-2),BD JC-1 試劑盒,細(xì)胞核DNA檢測,凋亡晚期 DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段 檢測方法 Tunel流式法，通過在核酸片段末端標(biāo)記計(jì)算凋亡百分比 DNA Ladder分析，但凋亡細(xì)胞太少時(shí)不好做,細(xì)胞核DNA檢測原理：APO-BRDU,TUNEL法 流式分析晚期凋亡,APO-DIRECT KIT 50 tests cat. 556381,一步法 實(shí)驗(yàn)用2種染料 PI染色總DNA：得到細(xì)胞周期的信息； FITC-dUTP染色凋亡細(xì)胞：檢測凋亡。 在流式細(xì)胞儀488nm激發(fā)下，PI發(fā)射約623nm熒光，F(xiàn)ITC發(fā)射520nm熒光。,TUNEL法 流式分析凋亡,APO-BrdU KIT 60 tests cat. 556405,二步法 PI染色檢測細(xì)胞周期 FITC