豬流行性腹瀉病毒

1、豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）簡介豬流行性腹瀉病毒( porcine epidemic diarrheavirus，PEDV) 屬于類冠狀病毒，引起豬流行性腹瀉病，仔豬感染此病毒后具有很高的死亡率PEDV 是一個正向包膜病毒，其基因組是正義單鏈RNA 5端有帽結(jié)構(gòu)( cap) ，3 端有Poly( A) 尾，基因組全長為28 033bp，基因組結(jié)構(gòu)如圖所示5端的2 /3 部分編碼2 個大的復制酶多聚蛋白ppla 和pplab，其余1 /3 基因組序列包括5 個ORF，編碼4 個結(jié)構(gòu)蛋白:纖突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖

2、蛋白(M) 和核衣殼蛋白(N) 以及ORF3 編碼的1 個非結(jié)構(gòu)蛋白復制周期首先S糖蛋白與受體結(jié)合,然后S糖蛋白被組織蛋白酶L剪切后活化一種融合肽,通過融合肽與細胞內(nèi)成分的融合作用介導病毒侵入宿主細胞。病毒粒子通過膜融合侵入宿主細胞內(nèi),然后釋放其具有感染性的基因組RNA。融合后緊密結(jié)合的病毒RNA與核衣殼蛋白N被釋放進細胞質(zhì)中,隨后在胞質(zhì)中脫衣殼,與核衣殼蛋白N緊密結(jié)合的病毒RNA基因組被釋放入胞質(zhì)中。首先,ORFlab翻譯成一個多聚前體蛋白,然后此前體蛋白被兩種蛋白酶,木瓜樣蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成為對病毒復制必須的單一蛋白,經(jīng)共轉(zhuǎn)譯處理后產(chǎn)生RNA依賴的RNA聚合酶

3、(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp以進入胞質(zhì)中的基因組RNA為模板,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負鏈RNA,然后以負鏈RNA為模板,合成不同長度的亞基因組mRNA(sgmRNA)和基因組RNA,復制酶、結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白也在這一時期產(chǎn)生。N蛋白與新合成的病毒基因組RNA在細胞質(zhì)中形成螺旋的核衣殼,核衣殼與固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間空隙的M蛋白結(jié)合后再與E蛋白結(jié)合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣殼。最后,包裹的核衣殼與在高爾基體內(nèi)經(jīng)糖基化等修飾的三聚體S蛋白結(jié)合,形成成熟的病毒粒子,通過胞吐作用釋放到細胞外。一 蛋白組成1. 纖突蛋白（Spike protein，S）2.

4、 小包膜蛋白（Envelope protein，E）3. 膜糖蛋白（Membrane protein，M）4. 核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）5. ORF3編碼的多肽6. 非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein）u Nsp1u Nsp2u Nsp3u Nsp4u Nsp5u Nsp6u Nsp7u Nsp8u Nsp9u Nsp10u Nsp11u Nsp12u Nsp13u Nsp14u Nsp157. 依賴于RNA的非結(jié)構(gòu)蛋白pol基因編碼（復 制 酶 多 聚 蛋 白lab， pplab）二 病毒分離方法一病毒粗提從無PED病史的健康母豬場取生后

5、2 d的新生仔豬,移入人工哺乳室人工喂奶,觀察2 d, 4日齡時口服華株病毒,24 h左右發(fā)病(水瀉、部分豬嘔吐)。撲殺病豬,取出小腸,輕輕擠去內(nèi)容物,將其縱向剪開,刮取小腸粘膜混合之,用pH7. 4的0. 01mol/L PBS(含0. 15mol/LNaCl, 1mmol/L EDTA-Na2)作110稀釋,反復凍融3次, 7 000g離心30m in,取上清,加PEG-6000(40% )和NaCl至終濃度分別為6%和2%, 4過夜后, 7 000g離心30m in,取沉淀,以PBS懸浮12 h以上。將重懸液15 000g離心30m in,取上清, 140 000g 4超速離心120m

6、in,以PBS重懸沉淀,重復差速離心12輪次。將沉淀用少量PBS充分懸浮,即得粗提病毒。 病毒精提將病毒粗制劑進行蔗糖(15%55% )密度梯度離心, 100 000g離心2 h。以長彎針頭自下而上吸取各帶少許,電鏡觀察純度,并用紫外分光光度計測定抗原蛋白濃度,用ELISA測定病毒效價。取純度高、活性強的樣品,對PBS或Tris-HCl-EDTA (TE)透析48 h,即得病毒純化制劑,作為免疫和檢測用抗原方法二取病死豬腸系膜淋巴結(jié)和己脫落的腸黏膜剪碎，置于無菌的研缽中，滴加5 -10倍體積的生理鹽水，反復研磨20 min，反復凍融3次后轉(zhuǎn)入EP管中加入青霉素(1 000 U/mL)鏈霉素(3

7、00 U/mL)37水浴1h;之后經(jīng)4 000 r/min離心30 min，取上清用0. 22 um的濾膜過濾之后用滅菌的EP管收集或直接取0. 6 mL接種在含有10%血清的MEM培養(yǎng)液中己長成單層的PK-15細胞，每隔6 - l0 h觀察細胞病變。三 疫苗研發(fā)1. 滅活疫苗（組織滅活疫苗和細胞滅活疫苗）優(yōu)點：組織滅活苗效果好，應用最為廣泛，細胞滅活苗制備方便，應用也越來越廣泛 缺點：滅活苗產(chǎn)生完全免疫力需要 2周時間，且劑量偏大，安全性2. 細胞弱毒苗可應用 PEDV 細胞弱毒苗經(jīng)口免疫晚期妊娠母豬，從而有效預防 PEDV 感染3. 乳酸桿菌疫苗（S基因）綠色環(huán)保、可食用的多功能黏膜免疫的

8、微生態(tài)制劑疫苗。目前，有的實驗室正在開展乳酸桿菌表達 TGEV、PEDV 主要保護性抗原基因的研究TGEV、PEDV 的 S 基因的克隆擴增工作亦已結(jié)束4. 轉(zhuǎn)基因植物疫苗（S基因）將 PEDV的S基因轉(zhuǎn)入煙草中，提取轉(zhuǎn)基因植物蛋白給小鼠注射或給小鼠飼喂這種轉(zhuǎn)基因植物可誘導小鼠產(chǎn)生全身免疫和黏膜免疫缺點：蛋白在植物中的表達水平低、表達產(chǎn)物在植物中的穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)基因口服疫苗在產(chǎn)生免疫反應之前在胃腸道內(nèi)有時被消化5. 核酸疫苗(基因疫苗、DNA疫苗)優(yōu)點：不散毒、不返強，標記性，性質(zhì)穩(wěn)定，制備工藝簡單和費用低，長期激發(fā)機體體液和細胞免疫反應缺點：核酸疫苗也存在整合到宿主染色體、致突變、產(chǎn)生抗菌素DNA 抗體等危險性豬流行性腹瀉核酸疫苗的研究還處于起步階段，是今后研究的熱點之一。6. TGEV 與 PEDV 二聯(lián)疫苗（二聯(lián)滅活苗和二聯(lián)活疫苗已完成）毒價高，后海穴接種 ( 是對常規(guī)免疫途徑的突破 )，增強了免疫保護力，一次接種即可，省時、省力 7. PEDV、TGEV、RV 三 聯(lián)滅活苗海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所采用豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV) 和豬輪狀病毒 (RV) 細胞培養(yǎng)物制備了三聯(lián)滅活疫苗PEDV 的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈 RNA。其中 Pol 基因在病毒感染早期發(fā)揮重要作用，S 基因被認為是發(fā)展有效抵抗冠狀病毒的主