單克隆抗體制備

1、實(shí)驗(yàn)研究的目的性 功能、形態(tài)、數(shù)量 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性 全面、動(dòng)態(tài)、鮮明、對(duì)應(yīng)、對(duì)照 實(shí)驗(yàn)方法的合理性 確切、先進(jìn) 實(shí)驗(yàn)原理的內(nèi)涵性 意義、要點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性 準(zhǔn)備、嚴(yán)格、準(zhǔn)確、重復(fù),免疫血清和單克隆抗體的制備,一、免疫血清的制備 1. 原理： 機(jī)體具有多種B細(xì)胞克隆，將適當(dāng)?shù)目乖镔|(zhì)注入人或動(dòng)物體內(nèi)后可被不同的B細(xì)胞克隆同時(shí)識(shí)別，經(jīng)過一定時(shí)間，受刺激的B細(xì)胞克隆針對(duì)抗原表位的多少而產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，每一抗原表位都能誘發(fā)相應(yīng)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生單克隆抗體，此獲得的血清即為含多種單克隆抗體的混合物，稱之為多克隆抗體免疫血清，簡稱免疫血清。 優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及

2、動(dòng)物的免疫應(yīng)答能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時(shí)間間隔和有無佐劑等因素。,免疫原 1.抗原種類 微生物抗原、組織抗原和免疫球蛋白抗原。 2. 抗原純度 一般的抗原只要達(dá)到親合層析或SDSPAGE電 泳純即可。 3. 抗原用量 在一定范圍內(nèi)與免疫應(yīng)答強(qiáng)度呈正相關(guān)。在應(yīng) 用完全弗氏佐劑時(shí)，蛋白質(zhì)類抗原劑量以0.5 1mg/kg體重為宜，加強(qiáng)免疫約為基礎(chǔ)劑量的 1/21/3。,4. 抗原的處理 1）顆粒性抗原：紅細(xì)胞、菌體等制成懸液，不需佐 劑，直接免疫。菌體數(shù)11010個(gè)/ml 為宜。 2）可溶性蛋白質(zhì)抗原（如人IgG）、病毒抗原、細(xì)菌 可溶性抗原組分等，可以直接與弗氏完全佐劑

3、（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化學(xué)藥品）需與載 體偶聯(lián)。常用載體有牛血清白蛋白（BSA）、鑰 孔嘁血藍(lán)素(KLH)、雞血清蛋白（OA）；偶聯(lián)劑 有過碘酸鈉、戊二醛和碳化二亞胺等。KLH是最 常用的載體蛋白，碳化二亞胺是最常用的偶聯(lián) 劑。,佐 劑 1. 概念 佐劑屬非特異性免疫增強(qiáng)劑，與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時(shí)，可增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型。 2. 種類 1）卡介苗（BCG）、短小棒狀桿菌（CP）、脂 多糖（LPS）、細(xì)胞因子； 2）氫氧化鋁、明礬； 3）雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和雙 鏈多聚腺苷酸：鳥苷酸（poly A：U）； 4）

4、礦物油、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物 （ISCOMs）、CPG寡核苷酸。,3. 弗氏完全佐劑 1）成分：羊毛脂、液體石蠟和滅活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液體石蠟 為1：2，也可1：1。 滅活卡介苗（2 20mg/ml）。 4. 弗氏不完全佐劑，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 劑。 5. 用法：佐劑與抗原等量混合，充分乳化。,動(dòng) 物 選 擇 對(duì)免疫動(dòng)物的主要要求有： 1. 應(yīng)選擇與抗原物質(zhì)親緣關(guān)系遠(yuǎn)的動(dòng)物，特別是在制 備抗免疫球蛋白血清時(shí)更要注意?？乖镔|(zhì)的來源 生物與被免疫動(dòng)物親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，免疫應(yīng)答能力越 強(qiáng)，抗體產(chǎn)生水平越高，抗體親和力也越強(qiáng)。 2. 動(dòng)物生理狀態(tài)正常，發(fā)育成熟，體重符合規(guī)定。家

5、兔初始免疫體重通常在22.5kg。 3. 性別上以雄性成年動(dòng)物較常用，也可采用雌性非妊 娠動(dòng)物。不能應(yīng)用患病或剛剛病愈、有免疫缺陷或 應(yīng)用免疫抑制劑的動(dòng)物。,免疫方法 1. 免疫途徑 1）注射方法：靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)和 淋巴結(jié)等。 2）免疫方法：小劑量、多點(diǎn)、多途徑方法。 3）顆粒性抗原（細(xì)菌懸液、紅細(xì)胞懸液）采用小 鼠腹腔注射。 4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐劑的乳 劑（油包水型），家兔背部多點(diǎn)皮下注射法。,2. 可溶性抗原免疫 1）方法：基礎(chǔ)免疫（初次免疫）后三周左右，進(jìn)行 加強(qiáng)免疫，以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次。 2）加強(qiáng)免疫次數(shù)取決于試血結(jié)果。家兔耳緣靜脈、 小鼠眶靜脈

6、少量采血，分離血清，免疫雙擴(kuò)實(shí)驗(yàn) 測定血清效價(jià)1：32或ELISA法測定抗體效價(jià) 1：10 000，表明抗體效價(jià)較高，可采兔頸動(dòng)脈 或心臟全部血液，分離血清。 4）如抗體效價(jià)較低，繼續(xù)加強(qiáng)免疫，一般需45 次。若仍不能達(dá)到抗體效價(jià)要求，應(yīng)考慮重新免 疫。 3. 顆粒性抗原免疫 第一周注射2次，隨后每周加強(qiáng)免疫1次，45天 試血。,3. 操作程序 1）健康雄性家兔體重2.5 3 kg，背部皮下多點(diǎn)注射。 2）基礎(chǔ)免疫：抗原完全佐劑 (抗原劑量4mg/只) 2ml (1:1V/V) 吸入兩支注射器內(nèi)，三通連接， 反復(fù)推拉混合至乳化懸液。 3）加強(qiáng)免疫：抗原不完全佐劑 (抗原劑量2.5mg/只)，

7、間隔710天加強(qiáng)一次。約23次。 4）試 血：末次注射后第7天取少量靜脈血，免疫雙 擴(kuò)試驗(yàn)血清檢測，抗血清效價(jià)1：32（或 ELISA法檢測抗體效價(jià)1：10，000）時(shí)頸 動(dòng)脈放血，分離血清，分裝，保存。,二 單克隆抗體的制備 1975年 Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個(gè)高度準(zhǔn)確的新紀(jì)元。,1. 原理 根據(jù)致敏的單一B細(xì)胞克隆具有分泌特異性抗體和骨髓瘤細(xì)胞在體外長期增殖的特性，采用細(xì)胞融合技術(shù)在體外可將上述兩種細(xì)胞融合形成

8、雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞因具備了B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雙重特性，即可分泌抗體，又能在HAT培養(yǎng)基中長期存活。因此，可通過HAT選擇性培養(yǎng)，篩選出克隆化目的雜交瘤細(xì)胞株，再利用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或雜交瘤細(xì)胞接種小鼠產(chǎn)生的腹水，獲取大量的來源于雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb）。,2. 試劑與器材 （1）細(xì)胞融合劑：聚乙二醇（PEG） （2）0.2mol/L L-谷氨酰胺貯存液 （3）200雙抗（青、鏈霉素）溶液 （4）RPMI-1640培養(yǎng)液 （5）15%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液 （6）100氨基蝶呤（A）貯存液 （7）100次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷

9、貯存液 （8）1 HAT培養(yǎng)液 （9）1HT培養(yǎng)液 （10）100 8-雜氮鳥嘌呤貯存液,（11）細(xì)胞凍存液：90ml含30%FCS的RPMI-1640培養(yǎng) 液+10ml DMSO （12）0.2M pH 7.4 磷酸鹽緩沖液 （13）主要儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置 顯微鏡、精密天平、低溫和普通冰箱、液氮罐、 離心機(jī)、高壓滅菌器、烤箱、水浴鍋、除菌濾 器、酶聯(lián)免疫測定儀等。 （14）常規(guī)實(shí)驗(yàn)器材：血細(xì)胞記數(shù)板、各種吸管、離心 管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、24孔和96孔培養(yǎng)板、 細(xì)胞凍存管、注射器、微量移液器等。 （15）抗體純化器材與試劑。 （16）小鼠實(shí)驗(yàn)器材：手術(shù)剪刀、鑷子等解剖

10、器材。 （17）骨髓瘤細(xì)胞：小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0或NS-1。,3. 實(shí)驗(yàn)流程 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫：BALB/c小鼠，雌性，68W。 常規(guī)免疫方案：0、15、30天，72 h后制備脾細(xì) 胞懸液。 基礎(chǔ)免疫：10100g抗原 (可溶性抗原)完全佐劑 0.2ml (1:1V/V) ，背部皮下多點(diǎn)注射。 加強(qiáng)免疫：同量抗原不完全佐劑，間隔710天一 次。約23次，皮下或腹腔注射。 試 血：取靜脈血，ELISA法檢測血清中抗體滴度， 當(dāng)效價(jià)達(dá)到 1：400以上時(shí)，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。 弱免疫原免疫方案：0天、30天、45天、60天、75天。,（2）免疫動(dòng)物脾細(xì)胞懸液的制備 ： 將末次免疫后3天BALB/

11、c小鼠處死，消毒，無菌取出脾臟，置入無菌PBS或培養(yǎng)液中。在100目的鋼網(wǎng)上研磨脾臟。收集細(xì)胞于50ml離心管中，1500rpm離心5分，去上清。加入10ml PBS用吸管輕微混勻，1500rpm離心5分，去上清，用10ml RPMI培養(yǎng)液懸浮。 細(xì)胞計(jì)數(shù)（細(xì)胞數(shù)/ml=N/4 104 稀釋倍數(shù)） 用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1108 /ml,（3）飼養(yǎng)細(xì)胞制備 在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其他活細(xì)胞則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的細(xì)胞稱飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。 將正常BALB/c小鼠腹部消毒后，注射預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液5ml，輕揉腹部數(shù)次，于腹部左下處

12、剪開腹膜，吸取細(xì)胞懸液，反復(fù)23次，用培養(yǎng)液離心洗滌2次。用15%FCS-RPMI-1640調(diào)細(xì)胞濃度為2105/ml，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，100l/孔。,（4）骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞用10FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)1周，23天換液一次，依細(xì)胞生長情況34天傳代一次，適宜密度3105/ml。融合之前3天，每天換一半培養(yǎng)液，使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長期。取對(duì)數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗2次，調(diào)細(xì)胞濃度為12 107 / ml備用。,（5）細(xì)胞融合 1）將骨髓瘤細(xì)胞與脾臟細(xì)胞按1：10或1：5的比例混 合，在50ml離心管中用無血清培養(yǎng)液洗1次，離心 棄上清； 2）1

13、min內(nèi)加入37預(yù)溫的1ml 50PEG溶液，邊加邊 搖37水浴1min； 3）加37預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔 2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml； 4）離心，棄上清，用含20小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液 重懸； 5）將上述細(xì)胞加入已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)， 每孔100 l ，放入37 5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。,（6）融合細(xì)胞觀察、換液及雜交瘤抗體檢測 細(xì)胞培養(yǎng)3天后，使用HAT培養(yǎng)液換液；3天后，再次使用HAT培養(yǎng)液換液。 當(dāng)細(xì)胞克隆集落大于3mm時(shí)，利用間接ELISA法篩選分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆。,（7）雜交瘤細(xì)胞克隆化 將分泌單克隆抗體

14、陽性的雜交瘤細(xì)胞克隆按有限稀釋法稀釋細(xì)胞（用HAT培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞），于96孔培養(yǎng)板中加入0.1ml/孔，培養(yǎng)2周，利用間接ELISA法挑選單個(gè)陽性雜交瘤細(xì)胞克隆孔并再次進(jìn)行亞克隆，直至亞克隆時(shí)全部克隆孔細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體檢出陽性率為100%為止。,（8）雜交瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 將陽性細(xì)胞克隆在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)， 收集細(xì)胞，離心1000轉(zhuǎn)、5分，棄上清，加入細(xì)胞凍存 液，移至凍存管，-70冰箱過夜，然后液氮長期保存。 將凍存管從液氮中取出，立即放入37水浴中， 使之迅速融化。用培養(yǎng)液洗滌1次后，加入培養(yǎng)液繼續(xù) 培養(yǎng)。,（9）單克隆抗體的大量制備 BALB/c雌性小鼠接種雜交瘤細(xì)胞前12周，

15、腹腔注射降植烷預(yù)處理。用無血清培養(yǎng)液洗滌雜交瘤細(xì)胞23次，調(diào)細(xì)胞濃度12106/ml，每只小鼠腹腔注射0.51ml細(xì)胞懸液。待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，收集腹水，離心，收集上清，分裝，-80保存。,（10）單克隆抗體純化 鹽析法 腹水10ml等量生理鹽水混勻，在電磁攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸胺20ml，4放置0.5h以上或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加生理鹽水20ml溶解后，再次加入飽和硫酸胺10 ml，4放置0.5h或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加盡量少生理鹽水溶解，裝入透析袋中，用流動(dòng)自來水透析40min，再用生理鹽水透析24h，中間換液34次，檢

16、測無NH4離子存在即可。-20備用。,凝膠柱層析 實(shí)驗(yàn)原理： 凝膠本身是多孔的分子篩，在交聯(lián)劑作用下形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)凝膠柱時(shí)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小不同，由大到小洗脫而進(jìn)行分離。（大分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒內(nèi)部，在膠粒間隙隨洗脫液最先流出。而小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入膠粒內(nèi)部洗脫較慢。） 關(guān)鍵點(diǎn)： 1. 裝柱切忌有氣泡和斷層，有斷層要重裝柱； 2. 加樣時(shí)緩沖液面恰好在濾紙片上，及時(shí)加樣避免柱 干涸，干涸凝膠不能繼續(xù)使用； 3. 因操作時(shí)間長，宜在4操作，防止影響免疫球蛋白 活性。,（11）單克隆抗體免疫學(xué)性質(zhì)檢定 1）單克隆抗體特異性測定； 2）單克隆抗體亞類測定； 3）單克隆抗體效價(jià)測定； 4）親和力測定； 5）識(shí)別抗原表位的測定。,4. 單克隆抗體制備的幾處要點(diǎn)： 1）相對(duì)分子量為4000的PEG融合效率最高。 2）免疫原性較強(qiáng)的抗原可不用佐劑，但一般可溶性蛋白 抗原免疫時(shí)需要佐劑，并且乳化要充分。一般多采用 背部多點(diǎn)注射法