WB免疫印跡實(shí)驗(yàn)常見問題全匯總

1、【干貨收藏貼】WB常見問題精品全集錦做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到的問題，分析可能的原因及對(duì)應(yīng)的解決方案，這就是實(shí)驗(yàn)成功的基石。以下，我們先解決很多技術(shù)菌的疑惑，然后再著手匯總實(shí)驗(yàn)中常見問題和可能原因分析以及給出建議解決方案。WB常見問題分析1.為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測(cè)到目的蛋白？原因有很多：a) 細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b) 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；c) 抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間

2、過長(zhǎng)。2.我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KDa），請(qǐng)問怎么做WB？a)可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可；b)也可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。3.我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；b)也可以將一抗稀釋比例降低；c)還可以延長(zhǎng)曝光時(shí)間。4.DAB好還是ECL好？DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECL結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。5.膠片是一片空白，是怎么回事？如果能

3、夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d)一抗選擇不當(dāng)二抗失活；e)二抗失活。6.磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。7.細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？一般5106就足夠。8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以

4、考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。9.大分子量蛋白200KDa，在做WB要注意什么？a)做200kd蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇7%的；剝膠時(shí)要小心；b)轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。c)轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那

5、么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和WB，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。11.WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用23次。稀釋后應(yīng)在23天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果？無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。WB 實(shí)驗(yàn)中常會(huì)出現(xiàn)各種問題，也跟技術(shù)菌們一起分享下 WB 實(shí)驗(yàn)中各種問題及應(yīng)用對(duì)策，希望給您的實(shí)驗(yàn)帶來實(shí)實(shí)在在的幫助WB問題匯總及解決建議問題原因解決方案條帶形狀不好看膠凝的不均勻，聚合不好灌膠前將溶液充分混勻某些樣品鹽濃度較高除鹽或

6、將樣品鹽濃度調(diào)成一致緩沖液陳舊，成分改變重配凝膠下面有氣泡電泳前先將氣泡趕走電泳時(shí)溫度過高降低電流或電壓樣品中含有不溶性顆粒樣品充分?jǐn)嚢杌靹螂姌O不平衡或者加樣位置偏斜調(diào)整電極和加樣蛋白條帶信號(hào)弱樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低加大上樣量或濃縮樣品轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流抗體濃度低增加抗體濃度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間封閉過度減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類型顯色劑失效更換顯色劑（吸取A、B液的槍頭不可混用）顯色或曝光時(shí)間不足延長(zhǎng)顯色或曝光時(shí)間HRP 抑制劑所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉轉(zhuǎn)膜效率低轉(zhuǎn)膜緩沖

7、液pH值與目的蛋白等電點(diǎn)相近提高轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值凝膠與膜之間存在氣泡轉(zhuǎn)膜前要排盡氣泡轉(zhuǎn)印膜種類選擇不當(dāng)使用質(zhì)量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜電壓或電流過小濕轉(zhuǎn)時(shí)20mA恒流，半干轉(zhuǎn)時(shí)25V左右恒壓轉(zhuǎn)印時(shí)間過長(zhǎng)或過短根據(jù)蛋白大小及轉(zhuǎn)印裝置選擇合適的轉(zhuǎn)印時(shí)間濕轉(zhuǎn)過程中環(huán)境溫度過高使用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置至于4度顯色或曝光后無條帶選用的一抗、二抗及顯色方法不合適選擇合適的一抗、二抗和顯色方法目的蛋白含量低于檢測(cè)下限加大上樣量或濃縮樣品抗體效價(jià)過低增加抗體濃度抗體孵育時(shí)間不足延長(zhǎng)孵育時(shí)間，37C孵育1小時(shí)以上抗體過度洗滌減少洗滌時(shí)間及次數(shù)，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多加入HRP底物反應(yīng)與曝光檢測(cè)之間

8、間隔時(shí)間過長(zhǎng)反應(yīng)3到5分鐘及時(shí)檢測(cè)背景高膜沒有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜洗膜不充分增加洗液體積和洗滌次數(shù)封閉物用量不足提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜封閉物使用不當(dāng)檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉封閉時(shí)間不夠室溫37度封閉1小時(shí)以上，4度封閉過夜抗體非特異性結(jié)合降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間一抗稀釋度不適宜對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最適宜的抗體稀釋度一抗孵育的溫度偏高建議4結(jié)合過夜抗體濃度過高或洗滌不夠降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間化學(xué)顯色底物過多按說明書加入適量的顯色底物蛋白條帶位置 （大?。┎粚?duì)相對(duì)電荷氨基酸電荷的組成膠濃度不同濃度的膠跑出的蛋白條帶

9、的位置可能有所偏差，調(diào)整濃度抗體孵育不充分增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間酶失活直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低設(shè)置陽性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量雜帶多目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作雜蛋白多處理目的蛋白抗體特異性不強(qiáng)使用特異性強(qiáng)的抗體抗體孵育時(shí)間過久減少抗體孵育時(shí)間二抗與抗原有交叉反應(yīng)選擇合適的封閉物二聚體或多聚體存在增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度底物顯色與曝光時(shí)間過長(zhǎng)縮短顯色及曝光的時(shí)間大分子量WB膜孔徑太小更換孔徑較大的膜轉(zhuǎn)膜電壓電流低提高電壓/電流轉(zhuǎn)膜時(shí)間短延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間膠濃度太大使用低濃