第11章生物素-親合素放大技術(shù)

1、第十一章生物素-親合素放大技術(shù)第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、理化特性二、親合素（或鏈酶親合素）的標(biāo)記第一節(jié) 生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、活化生物素二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)思考題小結(jié)第四節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用 三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用第三節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他第一節(jié)生物素理化性質(zhì)與標(biāo)記 I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合素結(jié)合 環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸側(cè)

2、鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一結(jié)構(gòu) 維生素H 動(dòng)、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高 MW 244.31kD.I 咪唑酮環(huán)羧基噻吩環(huán)一、活化生物素生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團(tuán)的衍生物活化生物素(生物素化衍生物)生物素活化標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標(biāo)記核酸的活化生物素活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素生物素羥基琥珀酰亞胺酯（ BNHS ）生物素N-羥基丁二酰胺 碳二亞胺如何減小空間位阻？ 長(zhǎng)臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間

3、添加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的距離 BNHS分子可與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基形成肽鍵 BNHS適用標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素與賴氨酸連接后，再與無(wú)水肼反應(yīng)而成。除醛基外， BCHZ還可標(biāo)記氨基標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來(lái)酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素標(biāo)記核酸的活化生物素 光生物素(photobiotin)側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán), 經(jīng)光照后, 變?yōu)榉枷慊趸?，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合, 形成B

4、-核酸探針 生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。 BNHS和BHZ可直接標(biāo)記核酸， 但對(duì)堿基配對(duì)有影響。二、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì) 活化生物素通過(guò)側(cè)鏈與蛋白分子連接； 一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記多價(jià)性； 對(duì)BNHS多標(biāo)記抗體,BHZ則多標(biāo)記微酸性抗原； 抗原、抗體標(biāo)記后活性不變； 可對(duì)標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后活性將降低； 選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性； 控制生物素：蛋白質(zhì)比例生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜為2:1, IgG應(yīng)用濃度0.55g/ml;生物

5、素13個(gè)/Ag，35個(gè)/Ab； 使用交聯(lián)臂減少空間阻力第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記親合素(avidin, AV) 和鏈霉親合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結(jié)合。一、理 化 特 性 親合素（A） 鏈霉親合素(SA)結(jié)構(gòu)PI結(jié)合位生物素Ka活性四亞基糖蛋白10.5色氨酸410151315四肽鏈蛋白 無(wú)糖基6色氨酸410151518二、親合素/鏈霉親合素標(biāo)記 標(biāo)記物：酶、膠體金異硫酸熒光素（FITC）HRP-AV(SA)過(guò)碘酸鈉、戊二醛ABC/SABC預(yù)制A

6、V(SAV)-Biotin第三節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他第四節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測(cè)自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)。一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理BAB法：Ag+BAbAg-AbBAAg-AbB-ABEAg-AbB-A-BE特點(diǎn)：以游離A分別連接B-Ab和B-EBA法Ag+BAbAg-AbBAg-AbB-A-BEAE特點(diǎn)：以A-E/SA-E代

7、替BAB法中的A，省卻了加B-E的步驟物ABCABC法A+BEA- BEABCAg+BAbAg-AbBABC Ag-AbB- ABC特點(diǎn):將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS在ELISA中的應(yīng)用生物素-親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測(cè)定三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS用于熒光抗體技術(shù)，通常采用BA法， 即用熒光素直接標(biāo)記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（BAB法） 或熒光標(biāo)記的抗親合素（或鏈酶親合素） 抗體的夾心法。四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的

8、應(yīng)用BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反應(yīng)后B、F成分的分離五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用以生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行的定位檢測(cè)用BAS制備的親和吸附劑進(jìn)行基因的分離純化將免疫測(cè)定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫- PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測(cè)思考題1. 生物素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？2. 生物素通過(guò)什么結(jié)構(gòu)、形式與生物大分子相連結(jié)？3. 親合素或鏈霉親合素的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有何特點(diǎn)？4. 為什么親合素、鏈霉親合素具有“橋聯(lián)”作用？5. 親合素、鏈霉親合素可以被哪些示蹤劑標(biāo)記？6. 為什么生物素親合素系統(tǒng)具有放大

9、作用？7. 生物素與親合素或鏈霉親合素的結(jié)合是否與抗原抗體結(jié)合相同？8. 生物素親合素系統(tǒng)放大的是反應(yīng)過(guò)程還是單一檢測(cè)信號(hào)的能量？9. 生物素、親合素或鏈霉親合素如何與標(biāo)記免疫技術(shù)聯(lián)接？10. 如何將生物素鏈霉親合素放大系統(tǒng)用于所有雙位點(diǎn)ELISA?小結(jié)， 生物素親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多級(jí)放大獨(dú)特效應(yīng)，可極大地提高分析測(cè)定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料的特性使該系統(tǒng)在標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和適用性。該系統(tǒng)有二種基本類型：以游離親合素為中間物，分別連接包含生物素化大分子的待檢反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素的BAB法或ABC技術(shù)；另一類是直接用標(biāo)記親合素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)的BA法或LAB。在生物素親合素（鏈霉親合素）放大系統(tǒng)應(yīng)用中，無(wú)論采用酶、熒光素或