




版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、第十一章生物素-親合素放大技術(shù)第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標記一、理化特性二、親合素(或鏈酶親合素)的標記第一節(jié) 生物素的理化性質(zhì)與標記一、活化生物素二、活化生物素標記蛋白質(zhì)思考題小結(jié)第四節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應(yīng)用 三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應(yīng)用五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用第三節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的特點一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他第一節(jié)生物素理化性質(zhì)與標記 I環(huán)為咪唑酮環(huán),可與親合素結(jié)合 環(huán)為噻吩環(huán),C2上戊酸側(cè)
2、鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一結(jié)構(gòu) 維生素H 動、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高 MW 244.31kD.I 咪唑酮環(huán)羧基噻吩環(huán)一、活化生物素生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團的衍生物活化生物素(生物素化衍生物)生物素活化標記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標記核酸的活化生物素活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中相應(yīng)基團偶聯(lián)形成生物素化標記物活化生物素標記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素生物素羥基琥珀酰亞胺酯( BNHS )生物素N-羥基丁二酰胺 碳二亞胺如何減小空間位阻? 長臂活化生物素(BCNHS): 生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間
3、添加了兩個6-氨基已糖分子基團,形成連結(jié)臂,生物素與大分子基團的距離 BNHS分子可與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基形成肽鍵 BNHS適用標記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì)標記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ):水合肼與生物素的合成物主要用于標記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ) :生物素與賴氨酸連接后,再與無水肼反應(yīng)而成。除醛基外, BCHZ還可標記氨基標記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素(MPB)能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素標記核酸的活化生物素 光生物素(photobiotin)側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團, 經(jīng)光照后, 變?yōu)榉枷慊趸剑芍苯优c腺嘌呤氨基結(jié)合, 形成B
4、-核酸探針 生物素脫氧核苷三磷酸(Bio-dUTP)作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物,可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。 BNHS和BHZ可直接標記核酸, 但對堿基配對有影響。二、生物素標記蛋白質(zhì) 活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接; 一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性; 對BNHS多標記抗體,BHZ則多標記微酸性抗原; 抗原、抗體標記后活性不變; 可對標記材料(如酶)標記:堿性磷酸酶標記后活性將降低; 選擇活化生物素:依抗原或抗體分子所帶可標記基團的種類(氨基、醛基或巰基)以及分子的酸堿性; 控制生物素:蛋白質(zhì)比例生物素:IgG 用量比(mg/mg)宜為2:1, IgG應(yīng)用濃度0.55g/ml;生物
5、素13個/Ag,35個/Ab; 使用交聯(lián)臂減少空間阻力第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標記親合素(avidin, AV) 和鏈霉親合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且,二者均為大分子蛋白,因此幾乎所有用于標記的物質(zhì)均可以同親合素(AV)或鏈酶親合素(SA)結(jié)合。一、理 化 特 性 親合素(A) 鏈霉親合素(SA)結(jié)構(gòu)PI結(jié)合位生物素Ka活性四亞基糖蛋白10.5色氨酸410151315四肽鏈蛋白 無糖基6色氨酸410151518二、親合素/鏈霉親合素標記 標記物:酶、膠體金異硫酸熒光素(FITC)HRP-AV(SA)過碘酸鈉、戊二醛ABC/SABC預(yù)制A
6、V(SAV)-Biotin第三節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的特點一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他第四節(jié) 生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強,各自均可以與各型大小分子結(jié)合,以及二者在結(jié)合反應(yīng)時具有的多級放大作用等優(yōu)越性,使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中,尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻。一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理BAB法:Ag+BAbAg-AbBAAg-AbB-ABEAg-AbB-A-BE特點:以游離A分別連接B-Ab和B-EBA法Ag+BAbAg-AbBAg-AbB-A-BEAE特點:以A-E/SA-E代
7、替BAB法中的A,省卻了加B-E的步驟物ABCABC法A+BEA- BEABCAg+BAbAg-AbBABC Ag-AbB- ABC特點:將BAB法中的A先與B-E結(jié)合,制備成復(fù)合二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應(yīng)用BAS在ELISA中的應(yīng)用生物素-親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS用于熒光抗體技術(shù),通常采用BA法, 即用熒光素直接標記親合素(或鏈酶親合素);也可采用游離親合素(或鏈酶親合素)搭橋,兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的生物素(BAB法) 或熒光標記的抗親合素(或鏈酶親合素) 抗體的夾心法。四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的
8、應(yīng)用BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測體系偶聯(lián),用于對終反應(yīng)的放大(BA法)BAS也可用于IRMA反應(yīng)后B、F成分的分離五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用以生物素標記核酸探針進行的定位檢測用BAS制備的親和吸附劑進行基因的分離純化將免疫測定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫- PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測思考題1. 生物素的分子結(jié)構(gòu)特點是什么?2. 生物素通過什么結(jié)構(gòu)、形式與生物大分子相連結(jié)?3. 親合素或鏈霉親合素的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有何特點?4. 為什么親合素、鏈霉親合素具有“橋聯(lián)”作用?5. 親合素、鏈霉親合素可以被哪些示蹤劑標記?6. 為什么生物素親合素系統(tǒng)具有放大
9、作用?7. 生物素與親合素或鏈霉親合素的結(jié)合是否與抗原抗體結(jié)合相同?8. 生物素親合素系統(tǒng)放大的是反應(yīng)過程還是單一檢測信號的能量?9. 生物素、親合素或鏈霉親合素如何與標記免疫技術(shù)聯(lián)接?10. 如何將生物素鏈霉親合素放大系統(tǒng)用于所有雙位點ELISA?小結(jié), 生物素親合素(鏈霉親合素)系統(tǒng)具有的多級放大獨特效應(yīng),可極大地提高分析測定的靈敏度;二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物大分子,又可連接標記材料的特性使該系統(tǒng)在標記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有很強的穩(wěn)定性和適用性。該系統(tǒng)有二種基本類型:以游離親合素為中間物,分別連接包含生物素化大分子的待檢反應(yīng)體系和標記生物素的BAB法或ABC技術(shù);另一類是直接用標記親合素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進行檢測的BA法或LAB。在生物素親合素(鏈霉親合素)放大系統(tǒng)應(yīng)用中,無論采用酶、熒光素或
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 唐山市常態(tài)化管理辦法
- 地鐵防水施工管理辦法
- 如何開展科研管理辦法
- 科技轉(zhuǎn)移機構(gòu)管理辦法
- 肥胖中醫(yī)辨證課件
- 野外測量培訓(xùn)課件
- 供電公司青年培訓(xùn)課件
- 房石鎮(zhèn)九年級數(shù)學(xué)試卷
- 福建閩侯小升初數(shù)學(xué)試卷
- 定興期末考試數(shù)學(xué)試卷
- 開油鍋紅袖章制度
- 江蘇譯林版小學(xué)英語單詞匯總表-帶音標可打印
- 高壓靜電場對儲藏果蔬保鮮效果的影響
- 護理規(guī)培結(jié)業(yè)考試復(fù)習題庫800題(含答案)
- 大學(xué)物理A1試卷B稿及參考答案
- 2023年考研考博-考博英語-揚州大學(xué)考試歷年高頻考點真題薈萃帶答案
- 企業(yè)管理一6S推行
- 滁州市機電工程學(xué)校工作人員招聘考試真題2022
- 診斷學(xué)血管檢查
- 無腳手架安裝方法講師用培訓(xùn)修改版
- 職業(yè)衛(wèi)生(副)高級職稱考試案例分析題及答案
評論
0/150
提交評論