口蹄疫液相阻斷ELISA

1、.,a型口蹄疫液相阻斷elisa,2015年12月,.,一、液相阻斷elisa基礎(chǔ)知識,液相阻斷elisa（lb-elisa）通途： 1、檢測口蹄疫感染，廣泛用于國際貿(mào)易中，是oie指定方法之一； 2、監(jiān)測牛、羊和豬等偶蹄動(dòng)物血清中口蹄疫免疫效價(jià)，評價(jià)口蹄疫疫苗免疫效果。,.,bl-elisa原理圖,待檢血清與病毒抗原混合液,捕獲抗體,檢測抗體,病毒酶結(jié)合物,顯色液,陽性不顯色 陰性顯黃色,.,bl-elisa反應(yīng)原理： 將預(yù)先滴定好的病毒抗原與被檢血清首先在液相中反應(yīng)，然后將抗原抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到包被了口蹄疫特異性抗體的elisa板中，沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被elisa板中的抗體捕獲

2、，再通過酶結(jié)合物與底物顯色。按照實(shí)驗(yàn)孔呈現(xiàn)顏色與抗原對照（未加血清）孔呈現(xiàn)顏色相比較判定結(jié)果。 抗體滴度以阻斷50%病毒抗原的血清稀釋度表示。,.,二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備,1、使用前，試劑盒所有組份應(yīng)回復(fù)到18-26，試劑要混合均勻，每個(gè)樣品使用一個(gè)吸頭。 2、濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋。,.,三、實(shí)驗(yàn)操作步驟,1、抗原抗體反應(yīng)布板,.,圖 2 96 孔酶標(biāo)板檢測 20 份樣品布局圖,.,1.1稀釋病毒抗原：用配制好的洗滌液在孔外6倍稀釋病毒抗原。 1.2待檢血清稀釋：在血清稀釋板上，使用洗滌液連續(xù)2倍稀釋每份被檢血清，每份血清稀釋2-8孔，根據(jù)檢測用途而定。使每孔最終量都為50vl。 1

3、.3稀釋陽性對照，參照步驟1.2，連續(xù)2倍稀釋，從1：16-1：1024。 1.4稀釋陰性對照，參照步驟1.2，連續(xù)2倍稀釋，從1：2-1：4。,.,1.5血清稀釋板加樣：使用稀釋好的病毒抗原加樣，其中預(yù)設(shè)的4孔病毒抗原對照孔按100vl/孔加入，其余待檢血清、陰陽性對照按50vl/孔加入。加樣完畢，所有樣品孔和因陽性對照孔稀釋度翻倍，變?yōu)閳D1圖、2所示。 1.6將加好樣的血清稀釋板封板，置于37反應(yīng)2h。,.,2、樣抗原抗體混合液及病毒抗原對照從血清稀釋板上按次序轉(zhuǎn)移到包被板上50vl/孔，封板， 37反應(yīng)30min。 3、洗滌液洗版5次，拍干。加抗體溶液 50vl/孔，封板， 37反應(yīng)35

4、min。 4、同上洗板5次，拍干。加酶結(jié)合物50vl/孔，封板， 37反應(yīng)35min。,.,5、同上洗板5次，拍干， 50vl/孔加入底物溶液（顯色液a和b按1：1混合），37 避光溫育15min。 6每孔再加50vl終止液終止反應(yīng)，立即在450nm波長下讀取od值。,.,.,四、結(jié)果分析,1、實(shí)驗(yàn)成立條件 病毒抗原對照od值應(yīng)在2.01范圍內(nèi)。 陽性對照抗體效價(jià)應(yīng)在1：10241滴度范圍內(nèi)。 陰性對照抗體效價(jià)應(yīng)1：8. 如果實(shí)驗(yàn)無效，實(shí)驗(yàn)中的操作值得懷疑，最好重新作一遍。,.,2、結(jié)果判定 抗原對照4孔，棄去1個(gè)最高和最低值，計(jì)算剩余2孔的平均od值，再除以2，即50%對照值，該值即為臨界值

5、，表示阻斷50%反應(yīng)的對照od450值。 備檢血清od450值臨界值，判為陰性； 備檢血清od450值臨界值，判為陽性；,.,每份血清系列滴度稀釋中，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該備檢血清的抗體效價(jià)。 若臨界值處于2孔之間，抗體效價(jià)取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數(shù)的反對數(shù)中間值，如果處在1：64和1:128之間，則該份血清抗體效價(jià)是1：90。 定性檢測時(shí)，兩個(gè)孔只有一個(gè)孔為陽性，則抗體滴度為1：128，2孔均為陽性，則抗體效價(jià)1：128.,.,抗體效價(jià)1：128，判為陽性； 抗體效價(jià)1：64，判為陰性； 抗體效價(jià)在1：64- 1：128之間，判為可疑；可以血清需要復(fù)檢，復(fù)檢抗體效價(jià)1：128，判為陽性；抗體效價(jià)1：64，判為陰性；,.,五、注意事項(xiàng),1、實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真閱讀說明書。 2、試劑盒所有濃縮試劑在低溫放置下，可能有無機(jī)鹽結(jié)晶，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，80溫育30min可溶解，且不影響實(shí)驗(yàn)。 3、所有試劑必須回復(fù)室溫使用，以免影響抗原抗體反應(yīng),.,4、溫育設(shè)備要精確度要高，溫度過高過低都會(huì)影響od值高低。 5、包被板反應(yīng)時(shí)嚴(yán)禁堆疊放置，應(yīng)平鋪且板間有間隙，切不可離箱壁太近。 6、所用移液器和設(shè)