血清蛋白電泳.ppt

1、血清蛋白電泳(Serum Protein Electrophoresis),血清和血漿,血清:是指離體的血液經(jīng)過(guò)自然凝固而析出的液體部分.血漿:是指離體并經(jīng)過(guò)抗凝的血液經(jīng)過(guò)離心沉淀后的上清部分.血清中無(wú)纖維蛋白原,簡(jiǎn) 介,人類血液中有125種以上蛋白質(zhì)成分。 白蛋白、脂蛋白、抗體、補(bǔ)體、凝血酶原和凝血因子、抗凝血因子、1-抗胰蛋白、 1-糖蛋白、2-巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其他微量蛋白等成分。,歷 史,1809年，Pehce(俄國(guó)物理學(xué)家)首先發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象 1937年，Tiselius(瑞典)制成界面電泳儀，應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究 1948年，Wieland和Fischer建立了濾紙電泳法，奠定了區(qū)帶電

2、泳技術(shù)的基礎(chǔ) 1959年，Raymond和Weintraub創(chuàng)建聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳和電泳技術(shù),電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。 電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。,應(yīng)用,電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外,最主要用于蛋白質(zhì),核酸等生物分子的研究.由于電泳法設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便,具有高分辨率及選擇性特點(diǎn),已成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的技術(shù).,COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI,電泳用于分離物質(zhì)的原理,電泳分類,按分離的原理不同：區(qū)帶

3、電泳、自由界面電泳、等速電泳、等電聚焦電泳 按支持介質(zhì)的不同：紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 按支持介質(zhì)形狀不同：薄層電泳、板電泳和柱電泳 按用途不同：分析電泳、制備電泳、定量免疫電泳和連續(xù)制備電泳。,影響電泳的因素,在電泳中,電場(chǎng),帶電粒子和促使帶電粒子移動(dòng)的介質(zhì)是產(chǎn)生電泳的三大要素.因而,影響電泳的主要因素有： 電場(chǎng)強(qiáng)度的影響 溶液的pH值 溶液的離子強(qiáng)度 電滲 溫度、分子大小、吸附作用等,電 滲,液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引起。如果電滲與電泳方向相同，V變大；反之變小。,血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳,原

4、 理,在 pH8.6堿性環(huán)境，血清蛋白均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng) 各種蛋白質(zhì)pI不同，帶電荷量有差異 蛋白質(zhì)的分子大小與分子形狀不相同 帶電荷多、分子量小者，泳動(dòng)較快；反之則較慢,電泳結(jié)果示意圖, 2 1,清蛋白,染色時(shí)染料與蛋白質(zhì)特異結(jié)合而不與醋纖膜結(jié)合，染色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比 染色一段時(shí)間后脫色，將各蛋白區(qū)帶剪下，經(jīng)脫色、比色即可計(jì)算出各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。 如同時(shí)測(cè)定出總蛋白濃度，還可計(jì)算出各蛋白組分的絕對(duì)濃度,正常血清電泳掃描圖譜,試 劑,緩沖液：巴比妥緩沖液（pH8.6 ） 染色液：麗春紅S染色液 漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液 洗脫液：0.1mol/LNaOH溶液,操

5、作,準(zhǔn)備 電泳槽準(zhǔn)備 CAM的準(zhǔn)備 點(diǎn)樣 吸3-5l血清均勻點(diǎn)于CAM無(wú)光澤面 電泳 無(wú)光澤面朝下，點(diǎn)樣側(cè)置于負(fù)極端，通電 染色 將薄膜條浸入麗春紅S染色液，染5-10min 漂洗,醋纖膜規(guī)格及點(diǎn)樣示意圖,定 量,取試管6支，在白蛋白管內(nèi)加入0.1mol/L NaOH液6ml，其余各管加入3ml，將各蛋白區(qū)帶剪下分別置于各試管中，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，3710-20min 向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加0.3ml,以中和部分NaOH 用520nm比色，以空白管調(diào)零，讀各管吸光度,計(jì) 算,設(shè)各部吸光度分別為AA、Aa1、Aa2、A、A。吸光度總和（AT）

6、為： AT= AA+Aa1+Aa2+A+A 白蛋白（%）（AA *2 AT）*100% a1-球蛋白（%） = （Aa1 AT）*100% ,注意事項(xiàng),通電時(shí)，不得接觸槽內(nèi)緩沖液或CAM，以防觸電 緩沖液液面要保證一定高度 標(biāo)本：血清應(yīng)新鮮，不得溶血 染料：對(duì)蛋白質(zhì)的各組分親和力相同，水溶性好，穩(wěn)定，吸光度敏感，形成的染料蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定且易洗脫比色,注意事項(xiàng),電泳后區(qū)帶拖尾、各區(qū)帶分開不明顯原因： 點(diǎn)樣過(guò)多 點(diǎn)樣不均勻、不整齊 樣品觸及薄膜邊緣；薄膜過(guò)濕，樣品擴(kuò)散； 薄膜未完全浸透或溫度過(guò)高導(dǎo)致干燥或水分蒸發(fā)薄膜與濾紙橋接觸不良 薄膜位置歪斜、彎曲，與電流方向不平行 緩沖液變質(zhì)；樣品不新鮮

7、CAM質(zhì)量不高等 電滲現(xiàn)象,評(píng) 價(jià),優(yōu)點(diǎn)：CAM電泳具有靈敏度高，標(biāo)本用量少，分辨率高，區(qū)帶清晰，電泳時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便快捷；CAM對(duì)染料不吸附，蛋白區(qū)帶均勻，背景清晰，既易比色定量，又易透明后進(jìn)行光密度掃描。 缺點(diǎn)：有輕微電滲現(xiàn)象，薄膜吸水性差，電阻容易增大，當(dāng)電流較大時(shí)，薄膜中水分極易蒸發(fā)，造成蛋白質(zhì)分子變性破壞。,臨床意義,各組分構(gòu)成,Alb：白蛋白 1：1酸性糖蛋白；1抗胰蛋白 酶；甲胎蛋白；高密度脂蛋白 2：觸珠蛋白；銅蘭蛋白；2巨球蛋白；脂蛋白 ：轉(zhuǎn)鐵蛋白；補(bǔ)體系統(tǒng)；脂蛋白 ：IgG；IgM；IgA；IgD；IgE； CRP,臨床意義,肝病型： Alb降低 和-球蛋白增高 出現(xiàn)和難以

8、分離，出現(xiàn) “-橋”，此現(xiàn)象往往是由于IgA增高所致， IgA與肝纖維化有關(guān)。見于急慢性肝炎和肝硬化。,臨床意義,M蛋白血癥型 Alb輕度降低 單克隆球蛋白（M蛋白）增高 在與-球蛋白區(qū)或-球蛋白區(qū)出現(xiàn)一條致密濃集的M蛋白帶 見于MM、巨球蛋白血癥等,臨床意義,腎病型：表現(xiàn)為白蛋白及-球蛋白降低， 2 和-球蛋白升高。見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等。 炎癥型：表現(xiàn)為1、2 和三種球蛋白均增高，見于各種急、慢性炎癥和應(yīng)激反應(yīng)。 蛋白缺乏癥：主要包括1抗胰蛋白酶缺乏癥、 -球蛋白缺乏癥等（較少見）,雙白蛋白血癥型,主要特征：在白蛋白部位有兩個(gè)區(qū)帶，掃描出現(xiàn)雙峰，呈剪刀狀。 產(chǎn)生原因： 持久型主要是一種家族性血清蛋白異常的疾病，極少見，為常染色體不完全顯性遺傳； 暫時(shí)型主要是指腎功能不全的患者在治療期間使用大劑量的-內(nèi)酰胺類抗生素，可形成快泳動(dòng)性的白蛋白成分，治療中斷即逐漸消失。,先天性白蛋白缺陷型,主要特征：由于血清白蛋白的顯著降低，血清總蛋白也隨之降低，1、2球蛋白