LYVE1在發(fā)育中大鼠腎內(nèi)的表達(dá)研究.doc

LYVE1在發(fā)育中大鼠腎內(nèi)的表達(dá)研究【摘要】目的探討淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體1染色陽(yáng)性（LYVE1+）淋巴管在大鼠腎內(nèi)的分布。方法胚胎期第14、16、18、20天的胎鼠，和出生后第1、4、14、21天及成年大鼠的腎臟切成厚50m的薄片，進(jìn)行LYVE1免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果LYVE1+的淋巴管叢最早可在胚胎期第16天的大鼠腎臟檢測(cè)到。在胚胎期第18天，出生后第1、4、7天和成年大鼠腎臟可見(jiàn)到LYVE1+叢主要位于腎臟皮質(zhì)的動(dòng)脈周?chē)?。LYVE1+細(xì)胞在胚胎期第14天可檢測(cè)到，主要位于髓質(zhì)，出生后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，到出生后第21天僅在外髓外帶見(jiàn)到少量的LYVE1+細(xì)胞。結(jié)論LYVE1+淋巴管主要位于腎臟的動(dòng)脈周?chē)?，LYVE1+細(xì)胞主要位于腎臟髓質(zhì)?！娟P(guān)鍵詞】淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體腎臟淋巴管【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedistributionofintrarenallymphaticvesselsindevelopingratusingthelymphaticmarkerLYVE1.MethodsTheratkidneysfromembryonicday14(E14)toE20,fromneonatesatpupday1(P1)toP21andadultswereinvestigated.ResultsLYVE1+lymphaticvesselsweredetectedandformedlymphaticplexusinratkidneyattheE16stage.FromfetalstageE18toAdult,LYVE1+lymphaticvesselsweredistributedalongarteriesincortex.LYVE1+cellsappearedmainlyinthemedullaatE14.Thenumbersofthecellsincreasedgradually,thenreduced.AtP21LYVE1+cellswereonlyinOSOM.ConclusionLYVE1+lymphaticvesselsweredistributedalongarteriesandLYVE1+cellswerelocatedinmedulla.【Keywords】LYVE1,kidney,lymphaticvessels在人類(lèi)和各種動(dòng)物包括小鼠其腎內(nèi)淋巴管的分布已有研究13，但是，對(duì)發(fā)育中腎臟內(nèi)的淋巴管的來(lái)源和分布目前知之不多。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記物淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體1(lymphaticendotheliumspecifichyaluronanreceptor1，LYVE1)研究大鼠腎臟內(nèi)淋巴管的表達(dá)。惡性腫瘤主要通過(guò)血道和淋巴道形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，統(tǒng)計(jì)表明，50%以上的腫瘤經(jīng)過(guò)淋巴道轉(zhuǎn)移，且發(fā)生較早，因此，本研究也為腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料與來(lái)源應(yīng)用SpragueDawley大鼠，試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及試驗(yàn)操作符合韓國(guó)加圖立大學(xué)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)的要求。孕鼠由韓國(guó)加圖立大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。出生前大鼠腎臟來(lái)自于胚胎期第14、16、18、20天的胎鼠，出生后腎臟由生后第1、4、14、21天及成年的大鼠獲得。每個(gè)年齡段應(yīng)用34只。1.2主要試劑兔抗小鼠多克隆抗體LYVE1購(gòu)自ResearchDiagnosticsInc（稀釋度11000）；過(guò)氧化物酶連接的驢抗兔IgG購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories（稀釋度1100），明膠、皂苷和牛血清白蛋白均購(gòu)自SigmaAldrich（美國(guó)）。1.3實(shí)驗(yàn)方法試驗(yàn)動(dòng)物用16.5%的烏拉坦（1ml/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉。妊娠1416d的大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剖腹取胎鼠，分離胎鼠腎臟，PLP固定4C過(guò)夜。利用振動(dòng)切片機(jī)（Pelco102,Series1000；TechnicalProductsInternational,美國(guó)）將腎臟切成厚50m組織片，放入-70C冰箱保存。出生后1421d及成年大鼠，PLP腹主動(dòng)脈灌注固定。分離腎臟，利用超薄切片機(jī)（Leica公司，德國(guó)）切成12mm厚，PLP固定4C過(guò)夜。從-70C冰箱中取出組織，新配制的50mMNH4Cl/PBS洗10min3次；0.3%H2O210min；緩沖液B（0.01MPBS100ml，明膠0.2g，皂苷0.05g，牛血清白蛋白1.0g）洗4h。以上操作均在4C環(huán)境中進(jìn)行。在緩沖液B稀釋的LYVE1中孵育，4C過(guò)夜。第2天從冰箱取出組織，先室溫放置1h，然后緩沖液C（0.01MPBS100ml，明膠0.2g，皂苷0.05g，牛血清白蛋白0.1g）洗1h。在過(guò)氧化物酶結(jié)合的驢抗兔IgG中孵育2h，緩沖液C洗30min。每孔滴加0.1%DAB300l，滴加3%過(guò)氧化氫溶液45l，顯色10min。梯度酒精脫水，丙酮15min2次，丙酮：環(huán)氧樹(shù)脂=31混合液內(nèi)1h，丙酮環(huán)氧樹(shù)脂=11混合液內(nèi)1h；丙酮環(huán)氧樹(shù)脂=13混合液內(nèi)1h，純環(huán)氧樹(shù)脂中過(guò)夜。封片，烤干。鏡下觀察，拍照。2結(jié)果2.1LYVE1在大鼠腎臟中的表達(dá)LYVE1+的淋巴管叢最早可在胚胎期第16天檢測(cè)到（圖1C）。在胚胎期第18天（圖2A），出生后第1（圖2B），4（圖2C），7天（圖2D）可見(jiàn)LYVE1+淋巴管叢主要位于腎臟皮質(zhì)的弓形動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈周?chē)D1A顯示成年大鼠腎臟，在皮質(zhì)LYVE1主要在弓形動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈周?chē)牧馨凸芎湍I小球內(nèi)表達(dá)，在髓質(zhì)也檢測(cè)到LYVE1的表達(dá)。2.2LYVE1+單個(gè)細(xì)胞LYVE1+單個(gè)細(xì)胞最早出現(xiàn)在胚胎期第14天的大鼠腎臟髓質(zhì)中。胚胎期，LYVE1+細(xì)胞主要位于髓質(zhì)，皮質(zhì)也可見(jiàn)到少量陽(yáng)性細(xì)胞(圖1C、D)。出生后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，出生后第4天到達(dá)頂峰（圖1E）。以后，這些LYVE1+細(xì)胞的數(shù)量從腎乳頭開(kāi)始逐漸減少(圖1G)，到出生后21天僅在外髓外帶見(jiàn)到少量的LYVE1+細(xì)胞（圖1I）。在成年大鼠，腎臟的間質(zhì)中未見(jiàn)LYVE1+單個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)(圖1A)。從圖1B、C、D、E、G和I可以看出，LYVE1+細(xì)胞形狀不規(guī)則，有多個(gè)粗而不規(guī)則的突起。A：在成年大鼠，皮質(zhì)LYVE1主要在淋巴管和腎小球表達(dá)（A），在髓質(zhì)的一些血管束（A）也有表達(dá)。B：在胚胎期第14天，僅有一些弱LYVE1+單個(gè)細(xì)胞，沒(méi)有LYVE1+淋巴管。插入圖分別顯示腎內(nèi)和腎外的LYVE1+單個(gè)細(xì)胞。C：在胚胎期第16天，LYVE1+單個(gè)細(xì)胞的數(shù)量急劇增加。C顯示LYVE1+單個(gè)細(xì)胞有粗而不規(guī)則的突起。DI：直到出生后第4天，在髓質(zhì)LYVE1+單個(gè)細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多，在腎乳頭（F，H）數(shù)量逐漸減少。出生后第14天和第21天在外髓外帶（OSOM）與外髓內(nèi)帶（ISOM）的交界處仍然有一些弱的LYVE1+單個(gè)細(xì)胞。E，G，I的插入圖顯示同一階段的LYVE1+單個(gè)細(xì)胞。K：腎臟，SC：脊髓，IM：內(nèi)髓，Co：皮質(zhì)。3討論淋巴流入血液循環(huán)系統(tǒng)具有很重要的生理意義，可以回收蛋白質(zhì)，運(yùn)輸脂肪和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)血漿和組織間液的液體平衡，淋巴流動(dòng)還可以清除因受傷出血而進(jìn)入組織的紅細(xì)胞和侵入機(jī)體的細(xì)菌，對(duì)機(jī)體起著防御作用。淋巴管系統(tǒng)很少發(fā)生威脅生命的疾病，除了少見(jiàn)的先天性淋巴水腫4和淋巴管瘤，大多數(shù)病理不清楚的良性腫瘤在兒童時(shí)期可導(dǎo)致毀容5。而且淋巴管也是腫瘤如乳腺癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌等發(fā)生轉(zhuǎn)移的途徑之一6，7。在一些疾病包括炎癥、自身免疫性疾病和癌癥，控制淋巴管的轉(zhuǎn)運(yùn)可能是治療的一個(gè)機(jī)會(huì)。因此。首先必須了解淋巴管的一些生物學(xué)特征。由于缺乏淋巴管特異標(biāo)記物和很難分離純的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞8，關(guān)于淋巴管的發(fā)生和發(fā)育研究發(fā)展非常緩慢。首次真正的進(jìn)展，來(lái)自于Alitalo及其同事8發(fā)現(xiàn)VEGFC是淋巴管發(fā)生的一個(gè)特異的生長(zhǎng)因子和酪氨酸激酶受體VEGFR3在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的研究9。最近，在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)別的一些受體，包括podoplanin，最先在腎小球足細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的膜蛋白10，11以及D6一種混雜的趨化因子受體12和巨噬細(xì)胞甘露糖受體13。這些標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，為研究淋巴管的發(fā)生和發(fā)育提供了可靠的檢測(cè)目標(biāo)，促進(jìn)了研究的進(jìn)展。LYVE1是目前最常用的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物14。LYVE1是CD44糖蛋白的同源化合物，分布于淋巴管內(nèi)皮，是一個(gè)跨膜糖蛋白，含有322個(gè)氨基酸殘基，是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸（HA）的受體15。LYVE1作為透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，可從周?chē)M織跨膜傳遞透明質(zhì)酸至淋巴管腔。通過(guò)LYVE1的作用，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞攝入透明質(zhì)酸，并在淋巴管、肝和脾竇內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行透明質(zhì)酸自身的分解代謝14。在生理狀態(tài)下，僅有少量透明質(zhì)酸進(jìn)行循環(huán)，而在組織損傷或其它病理狀態(tài)下，透明質(zhì)酸循環(huán)增加。同時(shí)，透明質(zhì)酸的代謝產(chǎn)物還可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管的發(fā)生，并能夠增加趨化因子的產(chǎn)生和聚集樹(shù)突細(xì)胞。在發(fā)育過(guò)程中LYVE1幾乎與Prox1同時(shí)表達(dá)，這種表達(dá)被限制在淋巴管和淋巴結(jié)的竇內(nèi)皮上16。LYVE1的這些特性使它為研究胚胎期和病理淋巴管發(fā)生提供了有力的工具17。我們應(yīng)用LYVE1作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)LYVE1+的淋巴管叢最早可在胚胎期第16天的大鼠腎臟檢測(cè)到。在胚胎期第18天，出生后第1、4、7天可見(jiàn)到LYVE1+的淋巴管叢主要位于腎臟皮質(zhì)的弓形動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈周?chē)?，提示淋巴管是與這些動(dòng)、靜脈幾乎同時(shí)發(fā)生的。成年大鼠腎臟，在皮質(zhì)LYVE1主要在弓形動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈周?chē)牧馨凸芎湍I小球內(nèi)表達(dá)，在髓質(zhì)也檢測(cè)到LYVE1的表達(dá)。令人感興趣的是，大鼠腎臟也檢測(cè)到LYVE1+單個(gè)細(xì)胞。這種細(xì)胞最早出現(xiàn)在胚胎期第14天的大鼠腎臟髓質(zhì)中。胚胎期，LYVE1+細(xì)胞主要位于髓質(zhì)，皮質(zhì)也可見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞。出生后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，出生后第4天到達(dá)頂峰。此后，這些LYVE1+細(xì)胞的數(shù)量從腎乳頭開(kāi)始逐漸減少，到出生后21天僅在外髓外帶見(jiàn)到少量的LYVE1+細(xì)胞。在成年大鼠，腎臟的間質(zhì)中未見(jiàn)LYVE1+單個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)。而且，LYVE1+單個(gè)細(xì)胞有粗而不規(guī)則的突起。然而，這些LYVE1+細(xì)胞存在的作用，目前還不清楚。有報(bào)道表明，LYVE1在一些巨噬細(xì)胞上也有表達(dá)18，19，這些LYVE1+巨噬細(xì)胞在淋巴管的發(fā)生過(guò)程中可能起重要作用2022。我們發(fā)現(xiàn)的LYVE1+單個(gè)細(xì)胞是否為巨噬細(xì)胞還是別的細(xì)胞，還有待于進(jìn)一步的研究。目前，這一方面的工作正在進(jìn)行?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1HolmesMJ,OMorchoePJ,OMorchoeCC.Morphologyoftheintrarenallymphaticsystem.CapsularandhilarcommunicationsJ.AmJAnat,1977,149:333351.2HoggCM,ReidO,ScothorneRJ/Studiesonhemolymphnodes.III.RenallymphasamajorsourceoferythrocytesintherenalhemolymphnodeoftheratJ.JAnat,1982,135:291299.3CuttinoJTjr,JennetteJC,ClarkRL,etal.Renalmedullarylymphatics:microrediographic,light,andelectronmicroscopicstudiesinpigsJ.Lymphology,1985,18:2430.4KarkkainenMJ,JussilaL,FerrellRE,etal.MolecularregulationoflymphangiogenesisandtargetsfortissueoedemaJ.TrendsMol,Med,2001,7(1):1822.5OrvidasLJ,KasperbauerJL.PediatriclymphangiomasoftheheadandneckJ.AnnOtolRhinolLaryngol，2000,109；411421.6AlitaloK,CarmelietP.Molecularmechanismsoflymphangiogenesisinhealthanddisease.CancerCell,2002,1:219227.7OliverG,DetmarM.Therediscoveryofthelymphaticsystem:oldandnewinsightsintothedevelopmentandbiologicalfunctionofthelymphaticvasculatureJ.GenesDev,2002,16:773783.8KarkkainenMJ,AlitaloK.Lymphaticendothelialregulation,lymphoedema,andlymphnodemetastasisJ.CellDevBiol,2002,13:918.9JussilaL,AlitaloK.VasculargrowthfactorsandlymphangiogenesisJ.PhysiolRev,2002,82:673700.10BreitenederGeleffS,MatsuiK,SoleinanA,etal.Podoplanin,anovel43kDmembraneproteinofglomerularepithelialcells,isdownregulatedinpuromycinnephrosisJ.AmJPathol,1997,151:11411152.11WeningerW,PartanenTA,BreitenederGeleffS,etal.Expressionofvascularendothelialgrowthfactorreceptor3andpodoplaninsuggestsalymphaticendothelialcelloriginofKaposissarcomatumorcellsJ.LabInvest，1999,79；243251.12NibbsRJB,WylieSM,YangJ,etal.CloningandcharacterizationofanovelpromiscuoushumanbetachemokinereceptorD6J.JBiolChem，1997,272:32,7832,83.13IrijalaH,JohanssonE,GrenmanR,etal.MannosereceptorisanovelligandforLselectinandmediateslymphocytebindingtolymphaticendotheliumJ.JExpMed，2001,194:10331042.14JacksonDG.BiologyofthelymphaticmarkerLYVE1andapplicationsinresearchintolymphatictraffickingandlymphangiogenesisJ.APMIS,2004,112:526538.15BanerjiS,NiJ,WangSX,etal.LYVE1,anewhomologueoftheCD44glycoprotein,isalymphspecificreceptorforhyaluronanJ.JCellBiol,1999,144:789801.16OliverG.LymphaticvasculaturedevelopmentJ.Na