熒光分光光度法測(cè)定面粉中核黃素(VB2).ppt

04 06 43 熒光分光光度法測(cè)定面粉中核黃素 vb2 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?實(shí)驗(yàn)原理三 fl 4500型氣相色譜儀四 實(shí)驗(yàn)步驟五 數(shù)據(jù)處理六 思考題 復(fù)旦化學(xué)系教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心包慧敏 04 06 43 1 掌握面粉樣品的消化方法 了解溶液的ph值等對(duì)核黃素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響 2 了解熒光分光光度計(jì)的主要結(jié)構(gòu)及工作原理 掌握其正確使用方法 3 熒光分析法基本原理和學(xué)習(xí)測(cè)繪核黃素的激發(fā)光譜和熒光光譜 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?04 06 43 二 實(shí)驗(yàn)原理 1 熒光 熒光分子 熒光物質(zhì)2 熒光分析法 特點(diǎn) 定量方法3 核黃素vb2 結(jié)構(gòu) 性質(zhì) 面粉中提取方法4 熒光分光光度計(jì) 結(jié)構(gòu) 原理 操作 04 06 43 熒光產(chǎn)生的機(jī)制 去活化過程 問題1 熒光 熒光分子 04 06 43 強(qiáng)熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 共軛 體系 剛性平面結(jié)構(gòu) 取代基 如熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)十分相似 熒光素在溶液中有很強(qiáng)的熒光 而酚酞沒有 如芴和聯(lián)苯在相同的條件下 熒光量子產(chǎn)率約為1和0 18 04 06 43 影響熒光發(fā)射溶液環(huán)境因素p 362 a 溶劑效應(yīng) 取決于熒光體和溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu) 極性 重原子效應(yīng) b 溫度 t f c ph平衡解離關(guān)系對(duì) f max f均有影響 溶液熒光的猝滅p 364熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間相互作用而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象稱為熒光的猝滅 或熄滅 引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑 04 06 43 問題2 分子熒光分析法 04 06 43 1 原子光譜與分子光譜原子光譜 電子能級(jí)躍遷 分子光譜 電子能級(jí) 振動(dòng)能級(jí) 轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷2 吸收光譜與發(fā)射光譜吸收光譜 從低能級(jí)向高能級(jí)躍遷 使光的強(qiáng)度減弱 發(fā)射光譜 從高能級(jí)躍遷回低能級(jí) 相應(yīng)的能量以光的形式輻射出來3 關(guān)系原子光譜 原子吸收光譜 原子發(fā)射光譜 分子光譜 分子吸收光譜 可見 紫外 紅外吸收光譜 光譜名稱的問題 04 06 43 原子光譜v s 分子光譜 原子光譜 線光譜 電子躍遷能級(jí) 單重態(tài) 三重態(tài) 分子光譜 帶光譜 電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí) 04 06 43 激發(fā)光譜熒光光譜 em max處if ex 吸收光譜v s 發(fā)射光譜 04 06 43 圖15 3三維熒光光譜的兩種表示 b 等高線光譜圖 a 等角三維投影圖 分子熒光光度法的一些基本概念激發(fā)光譜 熒光光譜 三維熒光光譜用途 04 06 43 熒光強(qiáng)度if與熒光物質(zhì)的溶液濃度c成線性關(guān)系 if 2 3 fi0 bc b 試樣的吸收光程 摩爾吸光系數(shù) f 熒光發(fā)射的量子產(chǎn)率 if 熒光強(qiáng)度 當(dāng)i0及b一定 稀溶液中 c 試樣濃度 if kc i0 入射光強(qiáng)度 熒光定量分析的基礎(chǔ) 04 06 43 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 工作曲線法 1 最大激發(fā)波長(zhǎng) 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制工作曲線 3 測(cè)定未知溶液 查得其濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線法求解k 1 圖解法 2 解析法 04 06 43 靈敏度高 測(cè)定下限在0 1 0 001 g ml 比分光光度法高2 4個(gè)數(shù)量級(jí) 光強(qiáng)i與i0的信號(hào)差別 熒光發(fā)射的光強(qiáng)選擇性高 適當(dāng)選擇激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光測(cè)定波長(zhǎng)產(chǎn)生熒光的化合物有限 不及分光光度法廣泛 干擾物質(zhì)較少 分子熒光分光光度法v s 紫外 可見分光光度法 04 06 43 三 f 4500型熒光分光光度計(jì) 比色皿 樣品槽 04 06 43 f 4500型熒光分光光度計(jì)光路圖 04 06 43 1 開機(jī)power xelamp main啟動(dòng)軟件flsolutionsprogram f 4500型熒光分光光度計(jì)的使用 04 06 43 2 波長(zhǎng)掃描wavelength scanstart method sample pre scan measure 數(shù)據(jù)處理 reportmethod f 4500型熒光分光光度計(jì)的使用 04 06 43 1 試樣溶液制備2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的測(cè)定 四 實(shí)驗(yàn)步驟 04 06 43 關(guān)于核黃素vb2 面粉中提取方法 面粉主要成分淀粉 蛋白質(zhì) 脂肪 礦物質(zhì) 維生素等 營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化面粉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 面粉中核黃素含量1 10 6 5 10 4g l 回收率為98 105 方法檢出限4 10 8g l 核黃素又稱維生素b2 維他命b2riboflavinec17h20o6n4微溶于水 對(duì)空氣 氧氣穩(wěn)定 對(duì)光敏感 在430 440nm藍(lán)光照射下會(huì)在525nm附近發(fā)綠色熒光 在ph6 7的水溶液中熒光最強(qiáng) 在ph為11時(shí)熒光消失 04 06 43 面粉10g400ml燒杯加0 1mol l鹽酸100ml冷卻后 用naoh調(diào)至ph6 0 6 5 然后立即加稀鹽酸至ph4 5將混合物定量轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶 用 5 95 醋酸溶液定容 離心取清液 避光 待測(cè) 1 試樣溶液制備 劇烈攪拌 倒入150ml沸水 維持微沸30min并攪拌使均勻分散核黃素在堿性溶液中不穩(wěn)定 要邊加邊搖防止局部堿性過強(qiáng)加1滴丁醇配平 離心取上清 04 06 43 1 激發(fā)光波長(zhǎng) 熒光波長(zhǎng)選擇吸取核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml于25ml容量瓶 用 5 95 醋酸溶液定容 暫設(shè)定熒光波長(zhǎng)即發(fā)射光波長(zhǎng)ex 525nm 在400 500nm波長(zhǎng)范圍對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描 記錄激發(fā)光譜曲線 取最大激發(fā)波長(zhǎng)em 在400 500nm波長(zhǎng)范圍對(duì)熒光波長(zhǎng)進(jìn)行掃描 記錄熒光光譜曲線 確定最佳激發(fā)光波長(zhǎng) 熒光波長(zhǎng) 2 酸度選擇取三個(gè)25ml容量瓶 各加入核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml 然后分別用1 1鹽酸 5 95 醋酸 5 naoh溶液稀釋到刻度 分別測(cè)定溶液ph值 測(cè)定熒光強(qiáng)度 考察酸度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 從中確定最佳酸度 2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的測(cè)定 04 06 43 五 數(shù)據(jù)處理 1 從熒光光譜圖上讀出最大激發(fā) ex 和發(fā)射波長(zhǎng) em 2 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法3 計(jì)算面粉提取液中維生素b2的含量 04 06 43 本實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1 溶液的配制 鹽酸濃度 naoh調(diào)節(jié)ph理論計(jì)算等2 標(biāo)準(zhǔn)溶液移取與稀釋操作3 系列標(biāo)液的測(cè)定順序4 樣品保存 防止光降解5 熒光儀的開關(guān)機(jī)順序 04 06 43 六 思考題 1 在熒光測(cè)量中 為什么激發(fā)光的入射與熒光的接收不在一直線上 而呈一定角度 2 試述熒光分光光度計(jì)與紫外 可見分光光度計(jì)在結(jié)構(gòu)上的有哪些不同點(diǎn) 3 定量測(cè)定維生素b2可用的方法有哪些 試比較各種方法的優(yōu)缺點(diǎn) 04 06 43 氧化型 還原型 問題3 面粉的主要成分 淀粉 蛋白質(zhì) 脂肪 礦物質(zhì) 維生素等